重组DNA转化

2015-12-24 07:41

浏览：115次

资料摘要：

目的：在体外连接组装而成的重组DNA分子只能转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。通过实验学会重组DNA转化的最基本的操作以及如何提高转化效率的基本思路。原理：带有外源dna片段的重组体分子在体外构建成后，需要导入适当的宿主细胞内进行繁殖或表达出具有一定生物活性的蛋白。能够作为重组体转化的受体，主要有动物细胞、植物细胞、微生物细胞等。导入受体细胞的途径重要有转化（转染），显微注射和电穿孔等多种不同的方式。可以根据不同的受体选择不同的导入方式。一般情况下，细菌一类的原核生物和酵母这样的低等真核细胞可用转化方式导入，而高等动植物细胞则需采用显微注射或电穿孔来进行。细菌表面通过CaCl2处理后，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，DNA分子能够通过质膜进入细胞。其进入细胞的方式是完整的双链DNA分子首先吸附到细胞表面，双链DNA分子解链变成单链，单链DNA分子一条进入受体细胞内，另一条被降解。进入细胞内的单链DNA则复制成双链环状DNA，随同复制子同时复制，并被转录翻译。仪器与主要试剂：（一）仪器 1．隔水式电热恒温培养箱 2．超净工作台 3．高速冷冻离心机 4．水浴锅（二）主要试剂 1．LB液体培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，用5mol/LnaOH调节PH值至7.4，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 2．LB固体培养基：在配制的液体培养基三角烧瓶中加入2克琼脂，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 3．抗菌素：（1）氨苄青霉素(A mp)用前在无菌试管中,用灭菌水配制,母液浓度为100mg/ml。（2）链霉素（Str）用前在无菌试管中, 用灭菌水配制,母液浓度为50mg/ml。 4．100mmol/L CaCl2 溶液：称取无水CaCl25.6克，加重蒸水至500 毫升，于103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。 5．50%的PEG6000溶液：称取50 克聚乙二醇6000加重蒸水溶解，定容至100毫升，103.42kPa（15磅）灭菌20分钟。实验方法（用CaCl2制备新鲜的感受态细胞转化法）：感受态细菌制备（1）挑取在平板上活化的菌落接种于2毫升LB培养液中，在370C培养过夜。（2）按1%挑取过夜培养菌接种于50mlLB培养液中，370C振荡培养2~2个半期小时（OD600约在0.2~ 0.4）。（3）培养物放冰浴中冷却10分钟。（4）分装离心管中，40C5000rpm离心5min，收集菌体，培养液尽量倒干净。（5）把菌体悬浮于10 ml的100mmol/L CaCl2 溶液，置冰浴中20min，40C5000rpm离心5min，收集菌体。（6）再将菌体悬浮于1-2ml的100mmol/L CaCl2 溶液中，40C保存，12-24小时后即可作为感受态细胞进行转化。转化实验（7）取200ml感受态菌，加入待转化的重组DNA（体积应小于10ml，DNA<50 ng）混匀后置冰浴中30min（一般同时要做阳性对照和阴性对照。阳性对照为加入已知量的未重组质粒DNA的感受态菌，用于检测转化效率。阴性对照为完全不加质粒DNA的的感受态菌，用于检测感受态细菌有无污染及检测抗生素的活性）。（8）放入冰浴中30 min，转入420C水浴90s，再冰浴1-2 min，加入培养液800ml，放370C振荡培养45min。（9）将适当体积已转化的感受态细胞均匀铺于平皿上。（10）待平皿中液体吸收后，倒置平皿，于370C培养12-16小时可出现菌落。

下载本篇资料：

资料文件名：

资料大小

下载

9.jpg

149KB

免费下载

如何进行辐射性杂交的制图

DNA的原位显示

相关资料

葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶一过氧化物酶法)

英文名称：PLP；Pyridoxal-5-phosphatemonohydrate；Pyridoxal-5-monophosphoricacidester；3-Hydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-methylisonicotinaldehyde5-phosphate；Codecarboxylase 其他名称：5-磷酸吡哆醛；吡多醛5-单磷酸酯；3-羟基-2-甲基-5-[(膦酰氧基)甲基]-4-吡啶甲醛一水合物；磷酸吡醛素；吡哆醛-5-磷酸酯；3-羟基-5-羟甲基-2-甲基异烟酰；辅脱羧酶 CAS号：41468-25-1 C8H10NO6P?H2O=265.15 级别：AR 含量：≥99.0% 维生素B6：≤0.5% 干燥失重：≤10.0% 重金属：≤20ppm PH(0.25%agSolution)：2.6～3.0 性状(以下信息仅供参考)：类白色至淡黄色或黄色粉末。熔点140～143℃。几乎无气味。无味。见光缓慢分解。易溶于甲酸、含水吡啶和稀碱液，微溶于水、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿和苯。水溶液在冷而避光处很稳定，0℃时3周

微生物检测冻干粉质控菌种说明书

阿尔茨海默病（AD）是一种全球范围内患病人口较多的神经退行性疾病。自发病起，患者的认知功能会逐渐衰退，病理表现为大脑中β淀粉样蛋白（Aβ）的累积、过度磷酸化的tau蛋白导致的神经纤维缠结以及神经炎症。 cGAS-STING通路是哺乳动物细胞检测外源DNA，并激活先天免疫反应的重要通路。它在缺血性脑损伤、帕金森病、亨廷顿病、脊髓侧索硬化症等神经疾病的发生发展中有重要作用，但是，cGAS-STING通路是否参与AD仍不清楚。近日，由中国科学院昆明动物研究所的曾健雄和美国南加州大学的赵振领衔的研究团队，在国际顶尖杂志《自然·衰老》发表关于cGAS-STING通路参与AD的最新研究成果[1]。他们发现在人类AD患者和衰老小鼠大脑中，cGAS与细胞质中的双链DNA结合，激活cGAS-STING通路，而敲除Cgas可以抑制AD模式小鼠的Aβ累积、神经炎症以及认知衰退。他们还发现，STING抑制剂H-151可以显著抑制AD模式小鼠大脑中cGAS-STING通路的激活，抑制AD病理进程。总的来说，这项研究揭示了先天免疫通路cGAS-STING和AD之间的重要联系，靶向

雌二醇特价促销 350/25g

英文名称：Estradiol；1,3,5-Estratriene-3,17beta-diol；17beta-Estradiol；3,17beta-Dihydroxy-1,3,5(10)-estratriene；Dihydrofolliculin 其他名称：β-雌二醇；雌甾二醇；雌甾-1,3,5-(10)-三烯-3β,17β-二醇；β-1,3,5(10)-三烯-3,17β-二醇；3,17β-二羟基-1,3,5(10)-雌甾三烯-3,17β-二醇；β-雌激素 CAS号：50-28-2 C18H24O2=272.38 含量：≥98.0% 熔点：173～179℃ 比旋光度：+76～+83°(C=2,5mol/LHCl) 水分：≤3.5%(KARLFISCHER) 性状(以下信息仅供参考)：白色或乳白结晶性粉末；无臭。本品在二氧六环、丙酮中溶解，在乙醇中略溶，在水中不溶。比旋度取本品，精密称定，加二氧六环溶解并定量稀释制成每1ml中含10mg的溶液，依法测定。用途：本品仅供科研，不得用于其它用途。保存：2~8°C

红豆杉染色体水平基因组测序完成

紫杉醇是目前已发现的最优秀的天然抗癌药物。紫杉醇生物合成途径已研究多年，而超大的基因组和复杂的代谢路线是途径解析的主要限制因素。中国科学院天津工业生物技术研究所与西北工业大学、深圳华大生命科学研究院等合作，首次完成了喜马拉雅红豆杉超10Gb的染色体水平的全基因组测序，并通过复杂基因组组装与分析，解析了红豆杉中生物合成紫杉醇的关键基因簇，探索了紫杉醇合成途径的起源与进化机制，为完全解析紫杉醇生物合成途径奠定了重要基础。全基因组倍增事件是开花植物提升环境适应能力，并逐渐替代裸子植物，遍布地球的主要原因。通过对裸子植物喜马拉雅红豆杉基因组的进化分析，研究发现在地球上存活更久的红豆杉却几乎没有经历过明显的全基因组倍增事件，而是发生了大量的基因串联重复事件，其比例超过了几乎所有已知的开花植物。大量基因串联重复导致红豆杉中的一些基因家族急剧扩张，随着这些家族重复基因的功能分化，红豆杉进化出非常复杂的代谢物合成和转录调控网络。例如，与紫杉醇合成密切相关的细胞色素P450酶家族与酰基转移酶家族，通过串联复制都产生了超过50份基因拷贝，如此多的重复基因为红豆杉进化出极其复杂的紫杉醇合成途径提供了遗传基础。迄今为止，已在紫杉科的植物中发现了超过500种具有紫杉烷类天然产物。因此，大量的基因串联重复是红豆杉中紫杉醇合成途径形成的主要进化机制，也可能是红豆杉能在地球上存活至今的重要原因之一

产品推荐