细胞DNA、RNA的分离鉴定技术

2015-10-28 08:01

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资料摘要：

一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。 (一)DNA提取方法： (1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。 (2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。 (9)加入RNAse A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。 (10)加入蛋白酶k至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。 (11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。 (12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。 (13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。 (14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。 (二)DNA纯度检测及含量计算 DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于1.75.低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于1.9表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此操作应轻柔。取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=1.8 OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。 DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL) DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。

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