植物总RNA的提取实验技术

2015-10-26 08:04

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一、实验目的通过本实验学习从植物组织中提取RNA的方法二、实验原理 RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍，可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。三、仪器、药品与试剂配方 (一) 仪器 1．低温离心机 2．分光光度计 3．琼脂糖胶电泳系统，用前先用1% Na OH溶液浸泡过夜，之后再用DEPC水浸泡冲洗。 4．高压灭菌锅 5．研钵、剪刀、一次性手套等 (二) 药品 1. 焦碳酸二乙酯(DEPC) 2. 吗啉代丙烷磺酸(MOPS) 3. 异硫氰酸胍 4. 醋酸钠(NaAc) 5. 氯仿 6. 苯酚 7. 甲醛 8. 乙醇 9. 乙二胺四乙酸(EDTA) 10. 琼脂糖 11. 异丙醇 (三) 试剂配方 1． 0.1% DEPC水 0.1 ml DEPC 加入100 ml三蒸水中，振摇过夜，再湿热灭菌。 2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L异硫氰酸胍、4 mol/L LiCl等均用DEPC水配制。 3. 5ΧMOPS 电泳缓冲液(pH 7.0) MOPS 0.1 mol/L NaAc 40 mmol/L EDTA 5 mmol/L 四、实验步骤（一）总RNA的提取（方案一） 1. 实验前10天左右播种水稻种子，在3-4叶期，剪取1.2 g幼叶。放入研钵，在液氮中研磨成粉末状，移入10 mL离心管。加入 4 mol/L异硫氰酸胍 4 mL 苯酚 3 mL 2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL 氯仿 0.6 mL 混匀，冰浴放置30 min。 2. 4℃，8000 r/min，离心13 min。 3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心管中。 4. 加入2倍体积无水乙醇，-70℃，0.5 h。 5. 4℃，8000 r/min，离心13 min。

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