FIDA：4分钟给您无稀释的冷冻电镜样品优化解决方案

·4分钟，高通量，40nL样品，无稀释，多维质控优化冷冻电镜样品·

冷冻电镜发展难题：不能忽略的样品制备技术

冷冻电镜（Cryo-Electron Microscopy）解析生物分子结构在过去的十年间迅速成为结构生物学领域中一种极具吸引力的方法。随着Cryo-EM的爆炸式普及，样品制备必须与时俱进，以防止工作流程中断，导致反复耗时的的实验过程。

目前，样品制备已成为工作流程中的主要障碍，部分结构生物学科学家和工程师将研究方向锁定在解决这一难题上。

随着研究的样品越来越异质化和复杂化，研究者需要更繁琐的优化流程以及更高的研究成本。虽然优化样品的技术层出不穷，但每种方法的效果因样品而异。目前，很多样品优化的结果主要取决于用户的专业知识和经验，这一过程可能会变得越来越耗时和具有挑战性。

样品优化和负染载网制备过程中会遇到许多变量，尤其是每个流程中都需要对样品进行稀释，因此很难确定因果关系。研究人员只能在电镜下对样品进行分子水平的评估。虽然一次制备载网的过程不需要太多时间，但为获得合适的条件而进行的反复试验却耗时耗力。从实际情况来看，这使得实验方案难以标准化。

为了简化目前的冷冻电镜样品制备流程，我们需要一种高通量，快速的，在无稀释条件下直接表征样品稳定性的技术手段。FIDA是一种基于第一性原理直接表征分子绝对水动力学半径的技术，可以实现无稀释，高通量，多维度表征样品的稳定性，是全新的样品质控解决方案。

评估样品优化参数多，一个完整流程往往需要多种仪器，每个流程中都需要对样品进行稀释，很难确定因果关系，导致高成本长时间优化后仍然不能得到完美的冷冻电镜结果。

英国知名的蛋白质科学服务公司PEAKProtein，使用FIDA对蛋白质进行全面QC分析，相较于传统QC方法，效率、精度及成本得到全面提升和改善，目前已经将FIDA技术全面应用于冷冻电镜相关技术的服务流程。实现了对原有采用SDS-PAGE、FSEC、负染的流程进行了优化。

FIG1.FIDA的冷冻电镜解决方案，从小规模构建，放大生产质控与样品优化全流程都大部分工作可直接通过FIDA完成，尤其是无稀释的样品优化，可大大提高得到高质量冷冻电镜数据成功率。

表1：蛋白质量表征技术比较

难题2 影响冷冻电镜结果质量因素很多，需要在样品制备与优化时采用多维度数据评估

FIDA技术单次运行只需要40 nL 蛋白质在 4 分钟内获得的完整蛋白质 QC 图，包括冷冻电镜样品QC的关键参数表征，例如多分散性指数（PDI），聚集（Agg），粘度（Viscosity），粘附性（Stickiness），完整性（R_h）等指标，FIDA是一种非常有效的支持所有生物物理学和结构生物学的基本工具。

其中需要强调的是FIDA不仅可以看到溶液中的蛋白质，还可以看到可溶性和不可溶性聚集体，并可以量化后者，而且可以确定寡聚状态并实际计算二聚化的 K_d。

FIDA所获得的R_h为绝对的粒径大小，可以直接与后期的电镜数据做比较。此外FIDA内置的 PDB 关联程序，可以将实际获得的 R_h 与数据库中的结构信息进行比较，有助于结构的精细解析。

FIG2. FIDA单次测试的8个质控参数

难题3 膜蛋白难以纯化，需要用去垢剂溶解，但有效提取膜蛋白的去垢剂不一定适用于冷冻电镜，需要高通量快速方法优化膜蛋白增溶条件

纳升级样品高通量膜蛋白的去垢剂增溶条件筛选

FIG3.用40nL的GFP标记的Lac-Y蛋白座位指示剂，采用11种不同去垢剂方案对蛋白溶解程度和PDI指数检测

FIG4.FIDA检测在11种去垢剂的GFP-LacY荧光信号峰值图和直方图

将FIDA检测的在不同11种去垢剂的GFP-LacY峰值图信号叠加，其中峰面积代表了溶解蛋白的浓度，将峰值面积整理成直方图显示了去垢剂溶解蛋白的能力。

FIG5.11种去垢剂中的GFP-LacY多分散指数（PDI）

FIG6.11种去垢剂中的GFP-LacY增溶效果排序

FIDA再根据峰值的形状计算了了不同去垢剂中蛋白的多分散指数（PDI），可确定样品是否在去垢剂中呈单分散状态，这是评估样品是否适合高质量单粒子冷冻电镜的关键指标。最后综合样品在去垢剂中的溶解度和PDI进行对不同组合排序可以得到最优的组合，并且最终结果与FSEC方法一致。

难题4 聚合蛋白低聚条件的条件高通量筛选

FIG7.aSOs-Alexa488样品在12种添加不同化合物缓冲液中的低聚物与单体比例

FIDA高通量评估在加入12种不同化合物缓冲液中预孵育后，aSOs-Alexa488样品聚合和单体的Rh和比例，在复合体/聚集体样品的制备和优化中可评估缓冲液体系是否能维持样本有活性的聚合状态。

FIG8. 膜蛋白在不同pH值、离子强度、温度、血浆浓度等条件下筛选

有一些蛋白在冷冻电镜前需要正确组装并保证其生物活性，例如一些药物靶点蛋白，以二聚体或多聚体的形式保持活性状态，或者某些蛋白复合物分子，很多情况下需要复杂的缓冲液优化或者需要在血浆、配体或细胞裂解液的环境中，这使得我们对样品制备质控时需要在多条件和复杂条件下对样品进行评估。

FIDA通过独有的流体诱导分子扩散原理，可实现对于分子的全面和绝对的质量表征，其极佳的灵敏度和分辨率只需少量的样品消耗，通过全自动进样系统实现高通量的无人值守操作。FIDA的第一性原理的单平台多参数功能极大提升了复杂实验的产出效率，其对不同样品的兼容性有望成为一款基础的结构生物学研究利器。