FIDA技术对小分子相互作用研究的案例

膜蛋白与小分子|三元复合物|磷酸酶与小分子|小分子结合引起构象变化|蛋白聚集体与小分子

小分子互作研究仍然是当今互作研究领域具有挑战性的方向之一，FIDA技术由于在底层物理原理上的优势，可以解决现有互作方法无法克服的一系列问题，例如结合质量变化不敏感，蛋白不稳定，结合构象变化小，蛋白表达量少，无法正交验证互作数据，多元互作无法有效表征，以及亲和力无法提供QC数据而存疑等问题，都制约小分子研究。而FIDA技术的出现有望打破互作行业内方法学的局限性，让小分子的互作研究更快，更准，更简单。以下汇总现有FIDA的一些案例，供大家参考。

应用一：FIDA多维膜蛋白与小分子互作解决方案

表征膜蛋白在体外的相互作用是一个重大的挑战，主要是由于膜蛋白在无配体状态和结合状态之间的质量变化十分微弱。这使得依靠一些通过使用分子质量变化来检测分子互作的的方法的不能获取有效的数据。

FIDA分子互作仪基于微流体的Taylor色散和Stokes-Einstein方程的物理原理，FIDA是表征绝对生物分子大小和相互作用的独特技术，原始数据包含广泛的信息，包括以流体动力半径R_h和BRIC(结合依赖的荧光强度变化)两种方式同步拟合亲和力数据，而且两种方式是完全正交且独立的，分别代表了其分子的粒径变化和构象变化，可以完美解决膜蛋白结合小分子后结合质量变化不敏感的问题。

此外，FIDA还是极其灵敏的Labelfree分子构象分析仪，通过全自动的化学变性实验可检测吉布斯结合自由能，即使蛋白不含有色氨酸残基，FIDA可检测到低至0.07ug/mL的低丰度蛋白（分子仅含有4个酪氨酸残基），大幅优于传统的nanoDSF技术，非常适合于珍贵的样品互作与稳定性实验。

图1. FIDA多维表征膜蛋白和小分子互作实验流程

FIDA中检测膜蛋白与小分子互作的同时引起R_h大小与荧光变化

用于滴定的膜蛋白总消耗量仅为 1.44 μL。实验观察到了明显BRIC信号变化，采用标准的 1:1 模型进行拟合（图 2b）。通过绘制水动力半径随配体浓度变化的图，揭示出一个显著的模式（图2a）。最初的粒径增加对应于0.5 nm的大小，在观察到BRIC的一半时达到平台期。这表明膜蛋白在滴定开始时采用了比起初更为扩展的构象。在这之后，出现了1.2 nm的收缩，表明膜蛋白从扩展构象转变为饱和复合物中的收缩形式。一种可能的解释是该蛋白质有两个小分子的结合位点。

这突出了通过Fida表征小分子-膜蛋白相互作用的额外好处，因为你不仅可以观察nL样品中R_h的变化，而且还可以因为相互作用而深入了解构象结构的变化。

来源：Fidabio Appnote https://www.fidabio.com/literature/small-molecule-interactions-with-membrane-proteins

应用二：FIDA “All-in-one”表征三元复合物——自动化In-Solution方案

Fida 分子互作仪可以提供快速、准确的测定三元复合物形成，Fida独有的三元复合物模型只需通过一次实验，“All-in-one”即可分析不同复合物的大小、百分比、亲和力和协同性等参数。本案例介绍了靶蛋白GSPT1、连接酶CRBN-DDB1、分子胶X (MGX)和来那度胺的研究。

首先测定未结合GSPT1的大小为4.27±0.06 nm。用100 nM的CRBN-DDB1混合物在Mol Glue X分子胶浓度增加的情况下进行滴定，产生s形结合曲线，证实三元复合物形成，总亲和力为11.1 nM。与CRBN-DDB1相同的滴定和来那度胺浓度的增加，但没有增加GSPT1的大小，即没有形成三元复合物。

图3.Mol Glue X，来那度胺和CRBN-DDB1，GSPT1三元复合物亲和力检测

图4.Fidabio软件对参数分析界面

在软件拟合模型中对实验数据集进行拟合得到的参数:

- Kd(亲和GSPT1和分子胶)

- Kd 2(亲和CRBN-DDB1和分子胶)

-协同系数(α)

-INDICATOR(GSPT1)的大小(Rh)

-二元复合物的大小(R_h)(GSPT1-分子胶)

-三元复合物的大小(R_h)(GSPT1-分子胶- crbn - ddb1)

Fida 分子互作仪提供了自动化的溶液内分析平台，通过R_h和BRIC(结合相关荧光强度变化)的正交读数来表征三元复合物的形成。在本例中，生成的数据分别为Molecular Glue X及其与靶蛋白和蛋白酶的相互作用。实验数据用Fidabio软件进行自动拟合，只需一次实验就可以获得表征三元复合物需要的所有参数(Kds， α和复合物尺寸-包括三元复合物的尺寸以及百分比)。

来源：Fidabio Appnote https://www.fidabio.com/literature/characterization-of-molecular-glues-an-automated-in-solution-platform

应用三：FIDA表征磷酸酶和小分子互作——肿瘤新靶点抑制剂研究

本案例中EYA1是一种卤酸脱卤酶磷酸酶和转录因子，在SHH髓母细胞瘤(SHH- mb)的肿瘤发生和增殖中起关键作用。苯扎酮已被确定为EYA蛋白的变构抑制剂。以苯扎酮为出发点，开发了DS-1-38（分子量347.42）作为EYA拮抗剂，并利用FIDA得到亲和力数据。

图5.EYA1全长与DS38 (E)和DS60 (F)的FIDA检测结果。DS38与EYA1结合，DS60不结合

为了确定DS38是否直接与EYA1结合，在案例中使用FIDA评估了当纯化蛋白与单个小分子化合物直接结合时，全长EYA1或EYA1催化结构域的构象变化，其中图E下方的荧光强度数据可得出，当DS38与EYA结合时荧光值变小，可得出结合后EYA1蛋白从扩展的构象变为塌陷的形式。

研究者在磷酸酶相关研究中都采用了FIDA，因为这种方法非常灵敏而且，对于使用少量自动荧光蛋白定量评估结合非常有用。通过这种方法，我们可以观察到EYA1的表观流体动力半径(R_h)和荧光信号随多肽或小分子浓度的增加而明显变化。

来源：Grace H. Hwang, Maria F. Pazyra-Murphy, Hyuk-Soo Seo, Sirano Dhe-Paganon, Sylwia A. Stopka, Marina DiPiazza, Nizhoni Sutter, Thomas W. Gero, Alison Volkert, Lincoln Ombelets, Georgia Dittemore, Matthew G. Rees, Melissa M. Ronan, Jennifer A. Roth, Nathalie Y.R. Agar, David A. Scott, Rosalind A. Segal; A Benzarone Derivative Inhibits EYA to Suppress Tumor Growth in SHH Medulloblastoma. Cancer Res 15 March 2024; 84 (6): 872–886. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-22-3784

应用四：FIDA发现小分子互作引起髓鞘碱性蛋白构象改变

图6.MBP结合后构象变化示意图

MBP是一种能够与麦芽糖分子特异性结合的蛋白质，其分子量为42.5 kDa，而麦芽糖的分子量为360 Da。两者的分子量相差约120倍，结合具有高度的特异性和亲和性，FIDA检测的结合常数（Kd）约为10 µM。当MBP与麦芽糖结合时，MBP从开放构象变为闭合构象，体现出明显的构象变化。这种变化可以通过FIDA技术进行精确检测和分析。

图7.FIDA软件拟合结果

通过FIDA技术的应用，本研究成功地揭示了麦芽糖分子与麦芽糖结合蛋白（MBP）之间的高亲和性相互作用及其引起的构象变化。

应用五：FIDA全自动高通量检测蛋白聚集体与小分子互作——神经退行性疾病

神经退行性疾病病理标志是错误折叠蛋白纤维聚集体的形成。使用示踪剂进行PET成像检测患者脑部的蛋白聚集体能够帮助我们了解、诊断病患的病程进展。然而寻找能够结合蛋白聚集体的新型小分子面临着诸多挑战。传统的分子互作检测技术受限于检测灵敏度、准确性纤维聚集等问题，在神经退行性疾病的研究中存在很多局限性。

在本研究中，研究者筛选了11种小分子化合物和帕金森氏症(α-syn纤维蛋白)和小分子互作结果，得出了小分子化合物和α-syn纤维蛋白互作导致聚集减少的三种机制。

表1.研究筛选的11种待测化合物

图8.（a） 在DOPG脂质体和化合物存在下，不同化合物滴定时最大种类的aSO-Alexa488的表观尺寸（R_h）。Rh的值和种类的百分比可以分别在左y轴和右y轴上读取。（b） 在化合物滴定下的游离αSO-Alexa488（即不含脂质体）的R_h

图8中的结果可得出，化合物A1、A2、A3、A4和A6完全阻止了aSO:脂质体复合物的形成，并保留了aSOs的原始大小（～10nm），表明化合物均不和αSO蛋白发生结合，也不减少低聚物产生（图第8a段）。其余5种化合物（A5、A7、A8、A9和A10）并没有完全阻止aSO–DOPG复合物的形成。

通过和ELISA数据对比，得出了图9中化合物和α-syn纤维蛋白互作的三种机制，部分化合物是与膜结合，与α-syn纤维蛋白形成竞争性结合，部分是与蛋白直接结合阻止蛋白聚集，另一部分是与蛋白和膜的复合物结合，减少蛋白对膜穿透性改变。

图9.化合物与α-syn纤维蛋白互作机制

来源：Somavarapu AK, Kleijwegt G, Nagaraj M, Alam P, Nielsen J, Otzen DE. Drug repurposing screens identify compounds that inhibit α-synuclein oligomers' membrane disruption and block antibody interactions. Chem Sci. 2023;14(11):3030-3047. Published 2023 Feb 21. doi:10.1039/d2sc05534a

FIDA对于小分子和不同蛋白甚至三元复合物的多维表征和对蛋白与核酸互作亲和力与动力学的的检测，是不依赖于分子量变化的，样本用量少（仅需40nL），甚至不需纯化蛋白样本，由于FIDA自带粘度补偿功能，能确保在任何溶液体系下的有效实验检测，是真正的完全不受缓冲液成分影响的多维互作表征技术。并且在每次检测中都可获得R_h和荧光强度的正交数据，一次检测即可对互作结果进行验证。

FIDA不止提供亲和力数据，还能解析互作产生构象变化与结合能变化曲线，让客户可以得到全方位解析互作的信息。