CNS前沿文献追踪 – SIM超分辨看DNA损伤修复过程中γH2AX

 回头看看，关于DNA损伤修复的文章分享了好几篇，索性又扒了扒老文章，找到了一篇17年的nature子刊，看的是DNA损伤修复过程中的γH2AX，具体内容如下：

作者想研究DNA损伤修复过程中γH2AX，先用共聚焦和WB看了一下伴随修复过程 γH2AX的变化趋势

 看看损伤后不同时间点细胞周期、增殖情况

作者除了想用SIM超分辨观察外，还想用ChIP-seq，又验证了一下抗体和测序

 准备工作做好之后，作者构建自己的方法：把SIM超分辨、ChIP-seq、数据库挖掘整合到一起，在纳米水平找到参与DNA损伤修复的结构单元

先用共聚焦和SIM（SIM原始数据可以转出宽场图片，对应pseudo-wide field；转出的宽场图片又可进行反卷积，对应+deconvolution）分别观察DNA损伤后不同时间细胞核内γH2AX蛋白点的数目，四种图片模式都反映出随修复进行γH2AX蛋白点先增多后减少的趋势，值得注意的是SIM宽场、SIM宽场反卷积、SIM计出的点数均比共聚焦多（光漂白、分辨率的限制造成了共聚焦计数偏低）

再看完随修复进行γH2AX点数的变化之后，又用SIM看了一下γH2AX蛋白点的尺寸

又拿分辨率更高的STED技术看了一下蛋白点的尺寸，发现STED测得的尺寸只比SIM测得的小了20%左右，验证了SIM超分辨的数据

再染γH2AX的同时，作者用DAPI还染了DNA，对γH2AX处DNA含量进行了测量，发现随修复进行，γH2AX处DNA含量先升高后降低

别忘了作者还计划了ChIP-seq，测序的数据观察到的DNA含量变化趋势和超分辨一致

ChIP-seq数据如果只看一个γH2AX包裹的DNA含量就亏了，作者将不同时间点的ChIP-seq数据和数据库放到一起，看损伤后不同时间点γH2AX在基因组上的分布情况，发现修复早期γH2AX主要分布在常染色质（以H3K36me3为marker），修复末期则分布到了异染色质（以H3K9me3为marker），暗示先修复常染色质再修复异染色质

ChIP-seq看到的γH2AX分布在SIM超分辨上验证一下，发现γH2AX的确是早期在常染色质上，末期在异染色质上

常染色质异染色质的DNA压缩程度不同，γH2AX随修复进行在常染色质、异染色质上分布的变化又让作者关注到DNA含量，修复末期DNA含量降低，且γH2AX周围shell区DNA的含量更高；修复末期异染色质上的DNA含量比常染色质低，这一反常现象暗示异染色质上DNA发生了解压缩

为了更加清楚的看异染色质处的修复行为，作者用CRISPR Cas9对一个异染色质基因进行了损伤

对异染色质上基因进行精准损伤后使得γH2AX分布到了异染色质上，用STED超分辨分析γH2AX和DNA的空间关系，发现γH2AX高的地方DNA含量低，暗示发生了去浓缩

Chromocentre圆度降低也暗示染色质发生了去浓缩 – 很有意思的发现：实际的染色质状态和组蛋白修饰出现了不一致，但同时暗示修复完成染色质状态会恢复

γH2AX、染色质状态搞清楚之后，作者又腾出手来进一步研究γH2AX的空间分布，SIM观察到更小的γH2AX点，共聚焦及宽场看到的点相对大一些，暗示SIM观察到的纳米级小点空间上会彼此接近成簇，共聚焦及宽场观察到的是纳米点组成的蛋白簇，所以作者对SIM观察到的纳米点进行了“聚簇”（挺有意思，这篇没观察到γH2AX呈环状分布，之前整理分享的那篇53BP1的nature观察到了），发现蛋白簇随修复进行升高后逐渐降低，每个蛋白簇大概包括4个纳米点

有了蛋白簇的概念之后，又看了随修复进行蛋白簇内DNA含量的变化 – 先升高后降低，末期降低现象和前面结论一致

γH2AX成簇分布有什么用呢？标记DNA损伤处（pKu70和TUNEL都代表损伤处）后，发现γH2AX以损伤处为中心聚集成簇（之前分享的那篇nature观察到成环，损伤处在环内）

聚簇现象是种空间上有序的排列，是有什么能够影响γH2AX的分布呢，CTCF能够调节染色质空间结构，ChIP-seq数据挖掘出γH2AX临近CTCF

实际用SIM超分辨看一下，发现两者空间上确实彼此靠近

用RNAi调低CTCF后，γH2AX形成受限，DNA损伤修复能力被削弱，暗示CTCF对γH2AX存在调控作用，影响DNA损伤修复

总结一个模式图：DNA损伤后，γHA2X围绕损伤点聚簇，先修复常染色质，后修复异染色质；修复时异染色质在维持组蛋白修饰的条件下发生了去浓缩；CTCF对γH2AX存在调控作用，影响DNA损伤修复

DNA损伤修复是老问题，γH2AX是经典分子，超分辨是新工具。新工具在老问题上使用，加成强大的数据挖掘能力造就了这篇文章，值得参考......

参考文献

Francesco Natale, Alexander Rapp, Wei Yu,w, Andreas Maiser, Hartmann Harz, et al. Identification of the elementary structural units of the DNA damage response [J]. Nature communications, 2017.

想了解更多CNS级期刊最新内容，请关注我们的公众号，常有更新哦，也可加笔者微信交流：qianle522568