CNS前沿文献追踪 – Amo1蛋白调节异染色质核内定位及基因沉默

DNA缠绕组蛋白形成核小体，连接到一起的核小体进一步折叠形成染色质，染色质分为常染色质和异染色质。异染色质分布在细胞核边缘，核小体排列更为紧密，组蛋白低乙酰化高甲基化，基因表达被关闭；常染色质分布在核内，核小体排布相对疏松，组蛋白高乙酰化低甲基化（上图来源于网络）。文章作者想研究异染色质核周分布及其调控基因沉默的分子机制

作者选取裂殖酵母交配型（mating type）基因为研究对象，交配型基因一部分被常染色质包裹，另一部分被异染色质包裹（对应基因片段呈沉默状态）。作者对异染色质包裹部分进行了改造，主要关注mat2P的表达：通常情况下这个基因被沉默无法表达，mat2P的沉默主要依靠两个机制，一个是异染色质包裹，另一个是通过其前面的REII序列召集组蛋白去乙酰化酶HDAC，为了只看异染色质包裹调控基因沉默的机制，作者把REII敲掉，在mat2P后插入了报告基因ura4（只要mat2P一表达，ura4跟着表达，表达ura4的酵母可在ura缺陷的培养基生长，不可在含添加FOA的培养基生长），除了通过酵母在条件培养基上的生长情况来判断原来被沉默的基因是否被表达外，还可以通过碘蒸气染色判断（如果mat2P不再被沉默发生了表达，酵母菌落会被染成黑色，mat2P处在沉默态时酵母菌落则被染成黄色）。将改造好的酵母于一个基因敲除酵母库中的各种酵母进行杂交，筛选能够调控异染色质沉默基因的蛋白

通过和库里的酵母杂交，筛选出了amo1和clr4：当这两个蛋白缺陷时酵母在添加FOA培养基上生长受限，在缺乏Ura的培养基上可生长，菌落染色呈黑色，说明Ura和mat2P发生了表达，异染色质对基因的沉默失效，暗示amo1和clr4参与调控异染色质对基因的沉默

文献报道amo1可能时核孔复合物的组成之一，但又不完全和核孔复合物共定位，作者实际看了一下amo1的定位情况：和核孔复合物部分共定位

用SIM超分辨能更清楚的看到amo1和核孔复合物的部分共定位现象

作者找到了“嫌疑犯”amo1，发现了“嫌疑犯”经常在核膜附近出没之后，想看它都和谁有接触 – 即看amo1可能和谁互作：通过纯化+质谱的方法筛出了一系列蛋白

IP验证，发现RIXC和FACT系列蛋白确实和amo1发生了互作

两个系列蛋白和amo1的互作是否参与调控amo1介导的基因沉默呢？功能层面验证一下，发现突变rix或敲掉FACT系列pob3后，沉默的基因发生了表达，说明通过挖互作蛋白找到的RIXC系列和FACT系列蛋白参与调控基因沉默

Rix和pob3参与调控基因沉默，那根amo1走的是同一通路吗？同时搞掉amo1、rix1或amo1、pob3后沉默基因的表达程度并不高于只搞掉amo1，暗示RIXC和FACT系列蛋白和amo1通过同一通路介导基因沉默

文献报道和文章作者前期的数据都还发现FACT、RIXC会和swi6发生互作，前面是通过amo1去拉互作蛋白的，amo1拉到FACT、RIXC，FACT、RIXC上挂的swi6可能就很少了，所以前面没挖到swi6吧，作者开始用swi6去拉，果然拉到了FACT和RIXC，IP实验也证明Swi6的确会和FACT和RIXC发生互作

为什么要一直挖互作蛋白呢？因为amo1定位在核膜和核孔复合物部分共定位，从筛选的结果来看它能调控异染色质介导的基因沉默，所以必定存在蛋白将amo1的“力”传到染色质上。Swi6就是定位在染色质上（它可结合甲基化的组蛋白，介导异染色质组装），因此和swi6互作的RIXC和FACT应该也会通过swi6在染色质上富集。果然当突变swi6或敲掉clr4（clr4是组蛋白甲基化酶，它缺失了甲基化降低，swi6就无处“落脚”了），RIXC和FACT在交配型基因序列附件富集减少，值得注意的是RIXC并没有完全消失，其在两侧元件还有部分富集，暗示存在别的机制介导RIXC定位到此，所以往下看

敲掉交配型基因两端序列后，RIXC富集消失，说明RIXC除了可通过swi6定位到交配型基因处外，还可通过交配型基因两端IR元件定位到交配型基因处

所有线索串在一起：amo1和RIXC、FACT互作，RIXC、FACT和swi6互作，swi6可和甲基化的组蛋白互作，形成了这样一条链amo1 - RIXC、FACT - swi6 – 组蛋白，这条链应该能将基因束缚在细胞核边缘（有文献报道人为的将基因束缚在核边缘能抑制基因的表达），实际验证，果然显微镜定位结果和互作结果一致，amo1通过FACT、RIXC、swi6将交配型基因mat拉到了自己身边，敲除amo1、RIXC或clr4后mat基因在核边缘定位降低，暗示amo1通过将基因拉到核边缘抑制基因表达

活细胞成像实验也验证了amo1有将mat基因束缚在细胞核边缘的作用

 Amo1可通过FACT、RIXC、swi6将异染色质包裹的mat基因拉到细胞核边缘，异染色质分布在核边缘，组蛋白H3K9甲基化、swi6调控异染色质组装，这些线索又提示amo1是否与异染色质组装相关，由于组蛋白H3K9甲基化对异染色质组装尤为重要，所以作者又去看了amo1对mat基因处组蛋白H3K9me的富集情况，往下看（上图来源于网络，出处是篇science，Role of Histone H3 Lysine 9 Methylation in Epigenetic Control of Heterochromatin Assembly）

果然，敲掉amo1或RIXC后，组蛋白H3K9me3在mat基因处的富集减少（着丝粒基因cenH和细胞内自带RNAi机制一起也能调控H3K9me3，ago和胞内RNAi机制相关，可见敲掉之后H3K9me3富集也会减少，和amo1和RIXC同时敲除，H3K9me3富集甚至消失）

cenH序列对H3K9me3的富集也有贡献，所以作者又对基因进行改造，搞掉这一段，用报告基因替换，单纯看amo1、RIXC对H3K9me3富集的影响，发现当amo1或RIXC缺陷时，H3K9me3富集显著减少，且可多代传递，暗示amo1、RIXC可通过影响组蛋白甲基化影响异染色质组装，可维持表观遗传

 通过互作挖出的还有FACT，FACT对异染色质组装是否有影响呢，答案时肯定的，敲掉FACT之后H3K9me3富集降低

进一步研究发现，amo1可促进FACT和swi6互作，当amo1缺陷，FACT富集降低

前面说明了amo1、RIXC、FACT在沉默mat基因、维持mat基因表观遗传的作用，它们这些作用是否具有一般性呢，作者建立了另一个序列的模型，看amo1是否对其他基因的沉默也能发挥作用：将甲基化酶clr4和TetR融合，TetR通过和tetO结合将clr4带到了ade6序列附近，引起组蛋白甲基化，造成基因沉默（菌落呈红色），在这样的菌种上敲掉amo1后发现ade6基因核边缘定位显著下降，原本被沉默的基因发生了表达（菌落不再呈红色），说明amo1对其他基因也有这种通过将基因束缚在核边缘沉默基因的作用

除了基因沉默作用，敲掉amo1、RIXC、FACT的菌种在解除clr4的甲基化后，H3K9me3富集很快消失，暗示amo1、RIXC、FACT也能维持其他基因的表观遗传

这篇文章中沉默基因、维持表观遗传出现了amo1、FACT、RIXC，它们“够”到基因部分是依赖swi6的，过表达swi6可rescue amo1缺陷，很有意思不能rescue FACT缺陷

作者还发现，当amo1、RIXC、FACT缺陷后组蛋白的更新增加，暗示这三个蛋白还有抑制组蛋白更新的作用，这个作用对维持表观遗传应该有贡献

最后总结个模式图：amo1可通过RIXC、FACT抓住swi6结合的甲基化的组蛋白（RIXC还可直接和基因元件结合），将染色质拉到核边缘，抑制基因的表达；amo1相当于抓住了组蛋白，可抑制组蛋白更新，维持表观遗传

作者可谓草蛇灰线：筛到amo1后通过找互作蛋白，一点一点的摸到了组蛋白上，而后通过显微镜共定位、活细胞成像呈现出amo1拉住被沉默基因的现象，读起来真痛快！但同时不要忽略的是我们在文章中看到的只是作者想让我们看到的、和作者想说明问题相关的，文章中出现的每个角色可能还有另一面，知道另一面就能讲新的故事̷̷

Sahana Holla, Jothy Dhakshnamoorthy, Diego Folco, et al. Positioning Heterochromatin at the Nuclear Periphery Suppresses Histone Turnover to Promote Epigenetic Inheritance [J]. Cell, 2020.

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