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酶标仪科普专栏丨第二期：荧光偏振（FP）介绍及应用

北京德泉

2024/09/05 18:25

阅读：4

在 FP 技术中，荧光染料被偏振光激发。当荧光染料被单平面偏振光激发时，它会重新向所有方向发射光（即对激发光去偏振），因为它在激发和发射之间会移动和旋转。分子旋转是由于布朗运动造成的，这种运动在纳秒内发生，光的去极化程度与这种运动成正比。

在荧光偏振检测实验中使用小分子的示踪剂标记配体，如果配体处于游离状态，在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将去偏振化，检测到低毫偏振值（mP）；如果荧光标记的配体与生物大分子结合，旋转变慢，发射光保持偏振性，检测到高的毫偏振值（mP）。

FP 常见应用

激酶活性检测

FP 测定的一个主要应用是鉴定小分子对激酶的活性的调节作用。此类检测可用于测量底物的消耗或反应产物的积累。涉及抗体的检测，称为荧光偏振免疫检测（FPA），早期的激酶 FPA 测定使用荧光标记肽作为底物^[1]。未磷酸化肽具有低 mP 值，激酶在 ATP 的作用下对肽进行磷酸化，特异性抗体与磷酸化肽结合，测得高 mP 值，但此种方法操作复杂，灵敏度较低。

Molecular Devices 开发的 IMAP 技术能对激酶，磷酸酶和磷酸二酯酶进行快速，均质和非放射性的分析，非常适用于分析开发和高通量筛选，当 IMAP 结合溶液与磷酸化底物结合时，肽的分子运动被改变，引起标记在肽上的荧光分子的荧光偏振效应增加。

此外，也可以用竞争性结合的方式来检测底物磷酸化水平，荧光团标记的磷酸化肽与抗体预结合，从而产生高 mP 值。激酶磷酸化未标记的肽底物，从而置换标记的肽，降低 mP 值^[2]。

hERG 钾离子通道安全性筛选

hERG 通道是一种电压门控钾通道，在心脏的正常电活动中起着至关重要的作用。它可参与心肌细胞动作电位的复极化和终止，hERG 通道的阻断会导致心律失常甚至造成猝死，因此候选药物必须仔细筛选，以确保它们不与 hERG 通道结合^[3]。本实验中，如果 hERG 通道蛋白与 Predictor hERG 示踪剂结合，则该示踪剂会产生更高的荧光偏振。如果候选药物分子具有 hERG 阻断作用就会与 hERG 通道蛋白结合取代示踪剂，从而降低荧光偏振光。

蛋白-核酸相互作用

利用荧光偏振可以帮助揭开核酸结构和结合蛋白之间的相互作用，荧光标记的寡核苷酸在溶液中可高度自由旋转，受到偏振光的激发后产生的发射光偏振性低，如果和蛋白质发生相互结合，则旋转速度低，发射光偏振性增强，如果复合物解体，则发射光偏振性减弱^[4]。因此，这种方法还可以结合动力学研究，通过偏振信号的变化对 DNA 双链形成和解链过程进行实时监测^[5]，传统的放射性标记法成本高昂，并且由于 32P 半衰期短，探针必须经常重新标记，放射性同位素库存必须重新排序，相比于放射性同位素法，荧光偏振检测方案不破坏样本，操作更为简便，并且使实验员免受电离辐射伤害。

布鲁氏菌病诊断

布鲁氏菌病是一种由布鲁氏菌属细菌引起的传染性过敏性人畜共患疾病，该病主要通过接触受感染的动物以及摄入受感染的肉类或未经巴氏消毒的乳制品传播给人类^[6]。在中国，抗人球蛋白试验（Coomb's 试验）和血清凝集试验（SAT）与 Rose Bengal 平板凝集试验（RBT）一起用于布鲁氏菌病的诊断而，这些检测复杂和耗时，并且结果的解释容易受到主观因素的影响，时常产生假阴性结果。根据目前的情况，显然需要更可靠的测试来诊断布鲁氏菌病。荧光偏振技术作为血清学诊断的一种，具有独特的优势，FPA 作为一种新的免疫测定法被用于相对快速准确地检测抗体或抗原。FPA 的优点是反应时间仅为 5 分钟，既可用于个体检测，也可用于大规模现场筛选。此外，与传统测试不同，数据是通过电子方式获得的。因此，消除了任何主观性，取而代之的是快速分析、永久记录和轻松的数据传播成为可能。

荧光偏振检测本质上是免分离均相检测，因为它们无需分离步骤即可进行定量测量，即无需从溶液中去除任何组分。由于这些特点，荧光偏振技术在多个领域都有广泛应用^[7]，包括受体/配体研究、蛋白质/多肽相互作用、DNA/ 蛋白质相互作用、激酶检测、竞争性免疫检测等。特别是在生物医学、临床诊断等领域，荧光偏振技术发挥了重要作用。

优势

适用于高通量筛选

无放射性，使实验人员免受辐射伤害

均相检测，无需清洗步骤

相比于 HTRF、AlphaScreen 等检测手段，FP 是性价比更高的选择

局限性

标记分子与大分子物质分子量需要有一定差异，一般 10x 差异比较合适

荧光染料不宜过大，<1.5kD 比较合

对温度较为敏感

不提供动力学常数

参考文献

1.Hendrickson OD, Taranova NA, Zherdev AV,et al. Fluorescence Polarization-Based Bioassays: New Horizons[J]. Sensors (Basel). 2020;20(24):7132. doi:10.3390/s20247132

2.Hall MD, Yasgar A, Peryea T, et al. Fluorescence polarization assays in high-throughput screening and drug discovery: a review[J]. Methods and applications in fluorescence. 2016;4(2):022001. doi:10.1088/2050-6120/4/2/022001

3.Furutani K. Facilitation of hERG Activation by Its Blocker: A Mechanism to Reduce Drug-Induced Proarrhythmic Risk[J]. International journal of molecular sciences. 2023;24(22):16261.doi:10.3390/ijms242216261

4.Pagano JM, Clingman CC, Ryder SP. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes[J]. RNA. 2011;17(1):14-20. doi:10.1261/rna.2428111

5.Hemphill WO, Voong CK, Fenske R, et al. Multiple RNA- and DNA-binding proteins exhibit direct transfer of polynucleotides with implications for target-site search[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2023;120(26):e2220537120. doi:10.1073/pnas.2220537120

6.Dong SB, Jiang H, Wang LP. Progress in research and practice of brucellosis surveillance in China. Chinese Journal of Epidemiology. 2019; 40(7):870–874. doi:10.3760/cma.j.issn. 0254-6450.2019.07.025

7.Yan Y, Marriott G. Analysis of protein interactions using fluorescence technologies[J].Current opinion in chemical biology. 2003;7(5):635-640. doi:10.1016/j.cbpa.2003.08.017

关于美谷分子仪器

Molecular Devices 始创于上世纪 80 年代美国硅谷，并在全球设有多个代表处和子公司。2005 年，Molecular Devices 在上海设立了中国代表处，2010 年加入全球科学与技术的创新者丹纳赫集团，2011 年正式成立商务公司：美谷分子仪器 (上海) 有限公司。Molecular Devices 以持续创新、快速高效、高性能的产品及完善的售后服务著称业内，我们一直致力于为客户提供在生命科学研究、制药及生物治疗开发等领域蛋白和细胞生物学的创新性生物分析解决方案。

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