【CNS前沿文献追踪】使用3D SIM技术“直播”凋亡过程中线粒体DNA的释放

关于凋亡信号通路的研究已经很透彻：内源性途径中，位于线粒体外膜的BAK/BAX激活，线粒体膜通透性改变，细胞色素c释放进入胞浆激活Caspase（如下图）

过往的研究主要依赖WB技术从时间角度确证蛋白间信号的传递过程，此次整理分享的文章利用显微镜技术，从时间、空间两个维度，实时的观察到凋亡中线粒体DNA进入胞浆的过程。

研究者以永生化的小鼠胚胎成纤维细胞为工具：利用BCL抑制剂ABT-737诱导凋亡，在线粒体外膜蛋白TOMM20上fusion了HALO tag（可用JaneliaFluor-646标记-红色）用于定位线粒体，在线粒体DNA转录因子TFAM上fusion了mNeonGreen（绿色）用于定位线粒体DNA

给予凋亡诱导剂ABT-737后线粒体形态（红色）、线粒体DNA（绿色）分布发生了变化

活细胞显微镜数据：400s线粒体DNA（绿色）与线粒体（红色）共定位（黄色），到528s“红绿分开，黄色减少”线粒体DNA不再与线粒体共定位，到624s图片不再那么清晰-细胞不再贴壁，脱离了焦平面

基于前面的共聚焦拍摄结果进行3D重建：线粒体DNA（绿色）是逐步从线粒体（红色）中出来的，但未完全脱离

因为共聚焦显微镜分辨率有限，所以利用3D SIM显微镜进行观察：线粒体DNA（绿色）从线粒体“出来”但为完全脱离，线粒体（红色）呈杯状结构

文章关注的是线粒体DNA在凋亡中的变化，实时观察到了线粒体DNA（绿色）“离开”线粒体（红色）的现象，凋亡过程中细胞色素c也有“离开”线粒体的行为，因此又对细胞色素c进行标记，看细胞色素c（蓝色）和线粒体DNA谁先“离开”的 - 细胞色素c先于线粒体DNA“离开”

利用WB再看一下胞浆中线粒体DNA、细胞色素c出现的先后顺序：WB结果也表明细胞色素c先“离开”线粒体

细胞是台极其精密的机器，线粒体DNA离开线粒体必然有其分子基础，所以要到参与调控其离开的蛋白！前面观察到凋亡过程中线粒体形态发生改变，线粒体的形态主要受fision（分裂）fusion（融合）相关蛋白调控，如上图：fusion蛋白（Opa、Mfn1、Mfn2）缺失后均促进了细胞色素c和线粒体DNA离开

Fision调控蛋白Drp的缺失也能引起细胞色素c、线粒体DNA离开，但对“离开”作用影响并不像fusion蛋白那么大

线粒体DNA释放后会激活cGAS，引起cGas依赖的IFN-γ分泌，fision调控蛋白Drp的缺失并不会抑制线粒体DNA释放引起的IFN-γ分泌，说明线粒体DNA的释放不是fision依赖的

线粒体是一个与胞浆隔离开的小环境，物质的出入受mitochondrial permeability

transition pore (MPTP)调控，用CsA抑制MPTP后并不影响线粒体DNA的释放，说明线粒体DNA的释放也不是MPTP依赖的

Antimycin和Oligomycin A能引起线粒体膜电位变化，但不影响线粒体形态及DNA的释放，说明线粒体膜电位的丢失也不是DNA释放的基础

在发现线粒体形态调控蛋白、MPTP、线粒体膜电位均不对线粒体DNA的释放起决定性作用后，研究者把目光放到了BAK/BAX上，诱导凋亡后BAK/BAX（蓝色）分布发生改变且与线粒体（红色）、线粒体DNA（绿色）存在共定位关系

基于活细胞观察，在时间维度上，Bax聚集、线粒体形态变化、线粒体DNA释放、细胞色素c释放之间存在交叉关联

共聚焦数据重建后，共定位（空间维度）也发现了BAX和线粒体DNA释放存在关联

共聚焦数据重建得到的共定位结果在更高分辨率的3D SIM上得到了确认

3D SIM数据分析的结果又再更高分辨率的电镜上得到了确认：BAK/BAX在线粒体外膜上打了“孔”造成内膜包裹着线粒体DNA从线粒体脱离

光电相关显微镜最终确认（Correlative light and electron microscopy）线粒体DNA释放机制

笔者是从技术、工具的角度去审视一篇文章的，每篇文章都是在说明一个科学命题，各种技术、工具为科学家提供数据基础，每种技术、方法都有其优势、劣势，正因为如此科学家们才需要用多种技术、工具同时测量一个指标来互相弥补，避免因技术、工具的“系统误差”引起数据的偏差，最终导致错误命题的产生！活细胞成像就像视频和照片的关系 - 多个时间点获取蛋白间的空间定位关系更具可靠性，3D SIM应该是目前为止在时间分辨率及空间分辨率两个维度综合实力最强的技术！

Kate McArthur, Lachlan W. Whitehead, John M. Heddleston, Lucy Li, et al. BAK/BAX macropores facilitate mitochondrial herniation and mtDNA efflux during apoptosis.[J]. Science, 23 February 2018.

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