【应用笔记】-高通量3D细胞培养之干细胞分化研究

  导读
       细胞增殖、分化等生理活动与其生存的微环境有着密切联系。
       当前细胞生物学研究大多还是在2D培养模式下进行，培养环境与机体内生理环境差别很大，导致细胞在形态、功能以及细胞间通讯上与体内生理条件下存在明显差异。与之相比，先进的3D培养可以模拟体内的生理环境，让细胞在生理行为上与体内生理环境更接近。
       此外，3D培养让研发企业相当程度上摆脱了伦理上对动物实验的约?束，缩短了研发周期，提高了结果可信度，从而大大提高了企业竞争力。因此，很多生物及药物研发企业更倾向于使用3D培养细胞来开?展实验和研?究。
       3D培养的应用方向主要包括：干细胞分化及组织工程，癌症和肿瘤细胞生物学，癌症共培养模型，毒性筛选等。本期，针对干细胞分化实验的周期长、通量高、操作复杂等特点，小编将携BioTek产品为您介绍高通量自动化的3D培养干细胞分化研究方案。
       研究方案
       人类间充质干细胞（Human mesenchymal stem cells，hMSCs）是多能干细胞，这些细胞易分离且能够分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等细胞，在成熟组织修复中具有重要作用，因此是组织工程研究的重点。如图1，在384孔板中，分别使用2D培养和磁力悬浮3D培养hMSCs细胞，并将孔板置于BioSpa 8自动孵育器中进行细胞培养。

图1. 磁力悬浮3D细胞培养过程

 
       在细胞培养期间，使用EL406洗板分液系统自动更换培养基（每3天一次）后，由Cytation5明场成像验证细胞是否脱落（图2），避免换液过程造成的细胞损失。

图2. 更换培养基后检查细胞是否损失

（A-C）3D培养条件下三个时间点的细胞球明场图像，（D-F）2D培养条件下三个时间点的细胞明场图像，4×

        对细胞核、微丝、II型胶原进行荧光标记，使用Cytation5荧光场对2D培养进行自动聚焦成像（图3）；对3D培养细胞进行Z-层切成像（图4）。

图3. 2D培养hMSCs随时间向软骨细胞分化

(A-C)未分化细胞，(D-F)软骨向分化细胞，10×；蓝色：细胞核，绿色：微丝，红色：II型胶原

图4. 3D培养hMSCs随时间向软骨细胞分化

(A-C)未分化细胞，(D-F)软骨向分化细胞，20×；蓝色：细胞核，绿色：微丝，红色：II型胶原

       结果显示，在普通培养基中，细胞不会向软骨向分化；而在分化培养基中，无论是2D或3D培养条件，hMSCs均明显向软骨向分化。亦可发现，2D培养的细胞在第20天时即有大量脱落现象（图3），而3D培养条件下细胞状态很好（图4），表明3D培养更适合于长时间的细胞分化实验。
Gen5软件的Z-层切功能轻松实现多层图片的叠加，还原3D细胞球的真面目。

图5. 3D细胞球图像的形成
(A-C) 3D细胞球的单层图像，(D) Z轴叠加和投射处理后的3D细胞球图像，20×；蓝色：细胞核，绿色：微丝，红色：II型胶原

 
       图片处理后，Gen5软件的Dual-Mask功能可自动选出表达II型胶原的区域（图6），并对细胞软骨向分化进行定量分析（图7）。可以看出3D培养hMSCs分化程度随时间逐渐增加。

图6. Dual-Mask分析功能，自动选中表达红色荧光的区域 

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        本期介绍的方案中，BioSpa 8提供干细胞培养环境，EL406负责更换培养基，Cytation5完成所有的细胞成像，三台仪器完美无缝对接，近一个月的实验过程全自动进行，期间无需人为操作。
BioTek智能成像系统不仅适用于2D培养细胞，在3D细胞培养中具有高通量、自动化、低成本、应用广泛等优势，有利于加速组织工程领域的转化研究。

        美国伯腾仪器有限公司（BioTek Instruments, Inc.,）是全球领先的设计、制造和生产商，其产品一直保持美国原产地设计和制造。自从1981年推出第一款酶标仪，BioTek 逐渐发展成为以微孔板为基础、旨在提高医疗、制药、农业和研究等领域客户生产效率的全球领先者之一。BioTek产品线覆盖酶标仪、液体处理系统、成像系统、自动化系统，为客户提供全方位的技术服务。