CNS前沿文献追踪 - CAR-T、CRISPR Cas9“强强联合”

现有的CAR-T都是利用病毒等载体将编码CAR的基因序列随机整合到T细胞基因组内，这种随机的基因整合有引起细胞癌变的风险，此次整理、分享的内容是利用CRISPR Cas9系统将靶向CD19的CAR基因片段“定点”整合到TRAC（T-cell receptor α constant）位点，将CAR的表达置于TRAC的调控之下，这种“定点”整合不但不影响CAR的表达，而且还能够增强CAR-T的“威力”！

文章大概思路整理如下：

CAR的整合位点（TRAC第一个外显子5’末端）及实验流程 

CRISPR Cas9能有效的将TCR knock out，同时将CAR knock in - 蛋白水平 

CRISPR Cas9能有效的将TCR knock out，同时将CAR knock in - 核酸水平

相较于病毒载体组（RV-1928z）的随机整合，基于CRISPR Cas9的定点整合组（TRAC-1928z）CAR的表达变异系数更小、更均一 

In vitro实验中随机整合和定点整合CAR-T裂解肿瘤细胞的能力及自身增殖能力并无差异 

In vivo实验中TRAC-1928z定点整合组活性更好

对骨髓CAR-T、肿瘤细胞检测：RAC-1928z定点整合组（蓝色）CAR-T细胞数目不会减少，同时能使骨髓肿瘤细胞数目较少

对各组CAR-T细胞亚型进行分析：随机整合组（红色、绿色）亚型呈现终末分化（terminal differentiation）和疲劳亚型（exhaustion）

对各组CAR表达水平进行分析：定点整合组（TRAC-1928z）CAR-T在infusion之后CAR的表达水平不会下调，表达稳定，而随机整合组（RV-1928z-TCR-和RV-1928z）在infusion之后CAR的表达下调，且下调不是转录层面变化引起的 

让T细胞表达CAR之后（Transduction5天后）在无抗原刺激、静息条件下看CAR-T的自发分化及信号激活：随机整合组表现出自发的T细胞分化和信号激活 

抗原刺激后看细胞分化水平（细胞亚型、转录因子），随机整合组过快的进入了终末分化（terminal differentiation） 

上面验证了将CAR基因序列定点整合到TRAC调控之下所带来的优势-These results indicated that the improved efficacy of TRAC-CAR T cells is related to its CAR expression level by reducing tonic signalling and delaying T-cell differentiation upon stimulation. 那整合到其他位点会是怎样的效果？文章作者又额外做了B2M和几个启动子对CAR-T功能的影响，如下：

将CAR定点整合到不同位点以及在不同启动子调控之下CAR的表达水平

比较在无抗原刺激、静息条件下看CAR-T的自发分化：CAR的表达水平越高，自发分化越明显

选取有代表性的4组，比较在抗原刺激下CAR-T的分化：TRAC-1928z组和B2M-1928z组表现为central memory表型

评估不同CAR-T体内效果：只有TRAC-1928z组表现出抑瘤作用、提高存活率的疗效

比较各组在抗原刺激下CAR表达的调控模式：CAR的下调是基于受体的internalization之后的降解，而下调之后的上调需要转录层面的“支持”（提供新的mRNA）

Eyquem J, Mansilla-Soto J, Giavridis T, et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection[J]. Nature, 2017, 543(7643):113.

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