G课堂 | Typhoon 应用集锦（一） 在Western Blotting实验中的应用

Western blotting是研究蛋白表达最常用的经典技术，常用于检测靶蛋白的丰度、检测蛋白的修饰、蛋白相互作用研究中。常用化学荧光、化学发光和荧光三种方式对结果进行成像和定量分析。

1）化学荧光：

化学荧光采用ECL Plus底物代替化学发光检测底物ECL检测Western blotting信号，具有灵敏度高、线性范围宽的特点。ECL Plus试剂与HRP标记的二抗反应，反应产物在488nm激光激发下能够产生发射光，发射光通过Cy2滤光片由检测器接受，并转化为电信号。化学荧光可由激光共聚焦成像仪Amersham Typhoon检测，超大检测面积，可同时检测20张10×8cm印迹膜，其高通量的特点非常适合需要大量进行Western blotting检测的实验室。

2） 近红外双通道荧光

用近红外荧光标记的二抗取代HRP标记的二抗进行Western blotting检测，在抗体孵育结束后，即可直接利用激光共聚焦成像仪Amersham Typhoon进行成像，不需要添加ECL底物，不需要在暗室进行X光片曝光，减少了实验步骤，节省时间，也节约了实验成本。

印迹膜在近红外波段具有较低的自发荧光，使得在成像时容易获得极低的背景，保证检测的高灵敏度。同时，近红外荧光具有宽的线性范围，使得定量更准确。通过双近红外荧光标记的二抗，不需要stripping和reprobing即可在同一张膜上同时检测目的蛋白和内参蛋白，实现同一泳道内参蛋白归一化，使定量更准确。同时，双通道检测更便于研究蛋白磷酸化水平。

3）三通道荧光

使用双色荧光标记二抗和一个荧光直接标记的一抗，可以在一张膜上同时检测三个蛋白，如内参蛋白、目的蛋白和磷酸化蛋白。在磷酸化水平的检测中，引入内参蛋白归一化校正不同泳道间的上样量差异，使得实验设计更严谨，所得结果更准确。

Fig.1 Western Blotting 不同检测方法方法原理示意图

4）总蛋白归一化，定量更准确

利用上样的总蛋白含量进行泳道间归一化，避免了内参蛋白选择烦恼。总蛋白归一化可基于荧光染料的蛋白质预标记技术，即在上样前，通过Cy5染料将蛋白标记上红色荧光。电泳结束后直接获得SDS-PAGE电泳图像，无需染色；也可在转印结束后根据膜上Cy5信号强度，判断转印情况；总蛋白信号代替内参蛋白用于归一化处理，结果更准确。

总蛋白归一化与内参蛋白归一化相比具有：更宽的检测范围，更强的蛋白信号，含量不受处理条件影响的特点。

 好了，今天和大家分享的就是这么多了。

 新的学期已经到来，一定要抓紧学习，有所收获哦。Bye！

Amersham™ 品牌简介

20世纪40年代，Amersham（安马西亚,GE医疗生命科学的前身）开创了放射性同位素示踪剂产品，促进分子生物学的重大进展，最终创造分子生物学史上的里程碑，如DNA测序。

接下来的几十年间，Amersham继续为科学与医学做出重要贡献，如推出世界上第一款测量糖尿病患者的胰岛素水平的放射免疫分析试剂盒。Amersham创新传统为非放射性标记的发展做出重要贡献。1990年，Amersham ECL试剂成为第一个用于Western Blotting的化学发光底物，成为“化学发光”的代名词，至今文献引用排名第一。

GE 医疗生命科学提供广泛的Amersham化学发光、化学荧光与荧光检测的成像产品组合，成为业界的高质量和高可靠性的不二选择。

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