Cas9：为DNA切割而生

过去3年里， CRISPR——成簇的、规律间隔的短回文重复序列——革新了基因组编辑领域。CRISPR相关蛋白9（Cas9）由向导RNA引导，切割基因组特定位置的DNA，形成DNA双链损伤。本文主要简单介绍Cas9通过与目标基因结合，从而发生切割作用的过程。

为产生DNA双链断裂，Cas9必须对DNA的双链都进行切割。 因此，Cas9包含两个核酸酶结构域——HNH域和RuvC域。Cas9 的crRNA（CRISPR derived RNA）中存在一段与目标DNA互补的序列，以及一段短的前间区序列临近基序（protospacer adjacent motif, PAM），以此来识别目标位点。同时，Cas9靶向基因，还需要一条反式激活crRNA（trans-acting crRNA, tracrRNA）、tracrRNA与crRNA人工融合，形成一条具有引导作用的sgRNA。这种方法常用于基因组编辑试验中。SgRNA与目标DNA链结合后，会形成一个R形的环，crRNA的引导区域会侵入这一区间，与目标链形成碱基互补配对。RNA聚合酶II处也会形成一个类似的R环（图1）。R环形成后，Cas9的HNH域开始切割互补序列，而RuvC域则开始切割非互补序列。这两个酶的同步切割确保了要么同时切割了DNA的双链，要么两条链都不切割。

图1 Cas9和DNA双链的互动激活了Cas9的酶活力。Cas9切割造成的双链断裂是CRISPR介导的基因组编辑的基础。Cas9能稳定R环结构，机制和RNA聚合酶II稳定R环结构的机制类似。

Cas9能够单独与sgRNA结合，或与包含PAM序列的双链DNA结合，表明Cas9可以采取不同的构象状态，但仍然不能解释Cas9产生双链断裂的原因。在每个早期结构，HNH域活性部位和切割位点存在30埃米（3纳米）的距离。此外，RuvC域活性位点与DNA结合也并未在以前的结构中观察到，这是因为缺乏完整非互补链。Jiang等人报道的晶体结构捕获双链DNA，使其处于解旋状态。HNH和RuvC域各自靠近其切割位点。Cas9复合体的构象发生变化，比以往的DNA-包含结构都要紧凑。这一构象改变，驱动结构重排，促进高效协调的双链DNA切割。

双链DNA结合后，最突出的结构重排发生在HNH域，原本HNH域朝向双链DNA结合复合体，旋转180°度后，改为朝向互补链。连接HNH和RuvC域的区域也发生局部结构重排，通过与分离的DNA接触，稳定R环结构，并直接引导互补链入RuvC活性部位。总的来说，HNH域的重定向和连接部位的重排从结构上证实了HNH和RuvC域的变构效应。

为进一步了解Cas9如何与目标双链DNA结合，Jiang等人利用低温电子显微镜（cryo-EM）确定了Cas9-sgRNA域目标双链DNA结合后、分辨率为6埃米的结构，以及Cas9-sgRNA复合体分辨率为4.6埃米的结构。他们发现，Cas9与DNA双链的互动，会使DNA发生30度的螺旋转动，这一转动有助于R环的稳定。这一研究成果不仅阐明了Cas9与DNA结合的机制，也进一步证实了冷冻电镜的发展。虽然已有文献报道更高分辨率的冷冻电镜，冷冻电镜结构分辨率最终取决于样本本身。鉴于Cas9复合物相对小（约220 kDa），以及其构象的可塑性，Jiang等人达到的分辨率已臻至完美。

了解与DNA双链的结合激活DNA切割酶的机制，不仅能促进我们对Cas9切割特异性的理解，还为未来的基因组编辑体系提供了思路。基于Cas9的新DNA切割酶特异性更高，Jiang等人的研究推动了新切割体系的设计，有助于减少脱靶效应——目前基因编辑领域的最大顾虑。这种新的结构信息还为设计基于荧光的实验提供了蓝图。细胞内Cas9与DNA结合时，复合体构象发生变化，荧光分子发出荧光。