山东大学马春红教授等发现Siglec-9/Siglec-9L可作为潜在干预靶点

肝细胞癌（HCC）是世界上发病率和死亡率最高的肿瘤之一，其发病率和死亡率分别位列第六位和第四位。自然杀伤（NK）细胞是监测肿瘤的重要效应淋巴细胞，尤其富集于肝脏。然而，在大多数HCC患者中，肿瘤微环境（TME）中的NK细胞数量减少，功能受损，其影响与肿瘤分期和患者生存期相关。Siglec-9是一种与其配体Siglec-9L相互作用并限制NK细胞功能的蛋白质，因此被认为是一种潜在的治疗靶点。然而，Siglec-9/Siglec-9L 在 HCC 中的原位相互作用尚未见报道，也缺乏相关的干预策略。在此，本研究为了表明 Siglec-9/Siglec-9L 介导的细胞社会学，并确定靶向 Siglec-9 的小分子抑制剂，以提高基于 NK 细胞的 肝癌免疫疗法的疗效。

山东大学马春红教授、梁晓红教授、刘新泳教授以及山东大学齐鲁医院韩博教授作为共同通讯作者在Journal of Hepatolog发表题为“Increased Siglec-9/Siglec-9L interaction in NK cells predicts poor HCC prognosis and can be a targetable checkpoint for immunotherapy”的研究论文。研究发现了一种针对 Siglec-9 的小分子抑制剂，可以增强 NK 细胞功能，揭示了一种新的肝癌免疫治疗策略，值得进一步的临床研究。

本研究采用多重免疫荧光染色分析Siglec-7、-9及其配体在HCC组织中的表达模式。分析发现，Siglec-9及其配体的表达呈明显正相关，在肿瘤组织中，与Siglec-9+ NK细胞邻近的配体阳性细胞比例显著提高，并且以NK细胞为主，提示肿瘤微环境内Siglec-9与其配体有更强的相互作用，且该相互作用主要发生在NK细胞之间，表明Siglec-9/Siglec-9L可作为NK细胞上肝癌免疫治疗的潜在干预靶点。

然后，研究团队基于虚拟对接、生物膜干涉技术（BLI）和表面等离子共振技术（SPR），来鉴定有效的小分子 Siglec-9 抑制剂。在体外和 NCG 小鼠中进一步评估了治疗潜力。结果表明MTX-3937可以作为先导化合物，具有HCC免疫治疗的临床应用前景，为肝癌免疫治疗提供了新的靶点和策略。

实验部分

本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统对小鼠肝癌组织TMA样本进行扫多色荧光图像采集。通过Tissue Cytometry技术获得了精准的单细胞定量结果、空间定量数据及蛋白表达水平的量化。

Panel 1：DAPI、CD68、CD56、CD3、Siglec-9

Panel 2：DAPI、CD68、CD56、CD3、Siglec-9L、HepPar-1

Tissue Cytometry是一种先进的多色免疫荧光分析技术，它结合了组织学、细胞生物学和流式细胞术的特点，允许研究人员在细胞和组织层面上进行高分辨率、高通量的定量分析。本文作者利用Tissue Cytometry技术，对肝癌组织进行多色标记后，通过其精确定量、空间分辨率能力，整合蛋白结构研究数据和生物信息学数据，对肝癌临床组织芯片中Siglec-7和Siglec-9与其配体的空间分布特征进行详细分析。

文中利用Tissue Cytometry技术，通过单细胞及亚细胞结构的准确识别，构建了Siglec-9和Siglec-9L在肿瘤浸润的NK细胞（TINK）中的表达模式，结合临床数据验证其与肿瘤预后之间的关系。研究发现，Siglec-9及Siglec-9L在TINK中的表达显著高于正常组织，并且与患者的不良预后呈负相关，揭示了Siglec-9/Siglec-9L相互作用在肝癌发展中的潜在作用，并指出了它们作为免疫治疗靶点的可能性；通过可视化并量化Siglec-9和Siglec-9L在肿瘤微环境中的表达和相互作用，对NK细胞在肝癌免疫监视中的作用，以及如何通过靶向Siglec-9/Siglec-9L相互作用来增强NK细胞的抗肿瘤活性也进行了定量研究。

此外，研究者使用Tissue Cytometry技术对筛选出的小分子化合物MTX-3937验证发现其抑制Siglec-9信号通路来提高NK细胞的抗肿瘤能力，为后续的实验设计和治疗策略提供了重要信息。

值得一提的是，Tissue Cytometry技术提供了从亚细胞结构到组织水平的多层级单细胞空间分辨率，为原位数据的探索和验证提供了重要途径。

Figure 1. NK 细胞中 Siglec-9 表达上调与 HCC 患者生存率低有关

（B）HCC 组织中多重免疫荧光染色（Siglec-9，绿色；CD56，黄色；CD3，青色；CD68，红色；细胞核，蓝色）的代表性图像。

（C） 癌组织和癌旁组织中 Siglec-9 在指定细胞上的 MFI 和频率。CD3-CD56+ 表示 NK 细胞；CD3+CD56- 表示 T 细胞；CD68+ 表示巨噬细胞。

（D） 癌旁组织和癌组织中 Siglec-9+ 和 Siglec-9- NK 细胞分布的模型图像。

Figure 2. 在与 Siglec-9+ NK 细胞相邻的 Siglec-9L+ 细胞中，CD3-CD56+ 细胞占主导地位。

(A）HCC 组织中多重免疫荧光染色的代表性图像（Siglec-9L，绿色；CD56，红色；CD68，黄色；CD3，青色；HepPar-1，白色；细胞核，蓝色）。

(B）癌组织和癌旁组织中 Siglec-9L 在指定细胞上的 MFI 和频率。

(C) Siglec-9L 在肝细胞（左）和 NK 细胞（右）上的代表性图像。

(D) 16 名复发性和 8 名非复发性 HCC 患者癌组织中 NK 细胞和肝细胞上 Siglec-9L 的 MFI。

(E）癌组织中 Siglec-9 和 Siglec-9L 表达水平的相关性。

(F）癌组织中 Siglec-9L+/- 肝细胞周围 HepPar-1- 细胞的比例。

(G）Siglec-9+CD3-CD56+ NK 细胞（橙色）与 Siglec-9L- （红色l轮廓）或 Siglec-9L+ （黄色轮廓）邻居的细胞社会学。图中显示了代表性图像和x相邻频率。

(H）HCC 组织中与 Siglec-9+CD3-CD56+ NK 细胞相邻的 Siglec-9L+ 细胞中指定细胞群的比例。每个点代表一个样本的数据。