浙大医学院徐骁教授团队利用10色mIHC标记技术，挖掘肝细胞癌免疫治疗新思路

在全球范围内，肝细胞癌（HCC）以其高发病率和死亡率成为一大健康难题。中国作为HCC负担最重的国家之一，对有效治疗方法的需求尤为迫切。近年来，尽管免疫治疗为癌症治疗带来了突破性的进展，但HCC的免疫治疗响应率仍然不尽人意。在这样的背景下，一项针对HCC免疫微环境和RNA修饰作用的创新研究，为肝病治疗开辟了新的道路。

HCC的治疗面临着多方面的挑战，包括肿瘤的快速进展、治疗抵抗性以及复杂的肿瘤微环境。在众多治疗方法中，免疫治疗因其激活患者自身免疫系统攻击肿瘤的机制而备受关注。然而，HCC患者对免疫治疗的反应不一，部分患者甚至在治疗后病情加剧。因此，深入研究HCC的分子机制，探索新的治疗靶点，对于提高治疗效果、改善患者预后具有重要意义。

浙江大学徐骁教授、浙大一附院卫强副教授等团队在Cellular and Molecular Biology发表题为“Downregulation of N4-acetylcytidine modification in myeloid cells attenuates immunotherapy and exacerbates hepatocellular carcinoma progression”的文章。通过检测 HCC 免疫治疗期间各种免疫细胞亚群中 ac4C 水平的变化，验证了ac4C修饰在HCC免疫治疗中的重要作用。

作者通过构建原位移植小鼠肝癌模型并分离肿瘤浸润的免疫细胞，使用流式细胞术评估ac4C修饰强度。通过单细胞RNA-seq全面评估肿瘤浸润免疫细胞的变化并识别靶细胞簇。进行 RNA-seq 和 RIP-seq 分析以阐明潜在的分子机制。

然后本文研究者利用Tissue Cytometry技术，深入探究了RNA修饰ac4C在HCC免疫治疗中的作用。研究发现，ac4C修饰能够促进M1型巨噬细胞的浸润，减少骨髓源抑制细胞（MDSCs）的浸润，从而增强CTL介导的肿瘤细胞杀伤能力。更重要的是，高浸润的ac4C+CD11b+细胞与HCC患者的更好预后正相关，这为HCC治疗提供了新的生物标志物和治疗靶点。

实验部分

本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统对小鼠肝癌组织TMA样本进行扫多色荧光图像采集。通过Tissue Cytometry技术获得了精准的单细胞定量结果、空间定量数据及蛋白表达水平的量化。

Panel：DAPI,TCF1,CD3,CD11B,PD1,CD25,TIM3,CD4,CD8,ac4c

Tissue Cytometry技术通过先进的图像分析和数据处理能力，解决了传统方法在肿瘤微环境研究中的多个难题，在本文原位数据的获取及分析方面发挥了关键作用。

作者借助TissueCytometry技术，精确量化细胞密度和蛋白表达水平，为研究者提供了关于肿瘤微环境中细胞分布和状态的详细信息。通过对肝细胞癌中ac4C+CD11b+细胞分布密度的定量，分析了ac4C+CD11b+细胞比例与HCC患者预后之间的关系，发现高浸润的ac4C+CD11b+细胞与更好的预后正相关。

在空间多组学数据分析方面，作者借助TSA技术标记多色标记技术，在一张样本上实现了10种蛋白标记物的免疫荧光染色：TCF1 (C63D9, CST, USA), CD11b (ab52478, Abcam, UK), PD1 (D4W2J, CST, USA), CD25 (ab231441, Abcam, USA), TIM3 (D5D5R, CST, USA), CD3 (ab16669, Abcam, USA), CD4 (ab133626, Abcam, USA), CD8 (ab237709, Abcam, USA), 以及 ac4C (ab252215, Abcam, UK)。此外，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，作者评估了使用ac4C修饰抑制剂Remodelin hydrobromide（REM）对免疫细胞表型的影响，包括对CD8 T细胞、髓系细胞（CD11b+）、B细胞（CD20+）等的影响；分析了REM处理对髓系细胞中PDL1表达的影响，发现抑制ac4C修饰诱导了PDL1的表达；文章中对CTL（细胞毒性T淋巴细胞）的功能状态也进行了客观评估。

Figure 1. Ac4C+CD11b+浸润与HCC患者更好的预后相关。

(A)基于 TSA IHC 技术在 HCC 微阵列上观察多种标记物（DAPI、TCF1、CD11b、PD1、CD25、TIM3、CD3、CD4、CD8 和 ac4C）的图像。

(B) I02患者组织中显示了ac4C+CD11b+细胞和CD3+CD8+PD1+细胞的图像。

(C)计算肿瘤和邻近组织中的相对 ac4c+CD11b+ 细胞比率。

(D)计算ac4C+CD11b+细胞与T亚群之间的相关性分析。

通过对肿瘤的精准分型来推动癌症精准医疗，是国家关注及重大投入的重点项目之一。对不同肿瘤的常见靶点进行IHC标记技术，已经应用于临床肿瘤的辅助诊断。通过免疫荧光IF在一张样本中进行多色标记，不但可以获得以往结合多张IHC样本才能获得的多种标记标志物的阳性细胞含量，更可以通过空间距离分析其相互作用关系，这也正是肿瘤空间精准分型的意义。