Cell Reports|山东大学齐鲁医院发现CD8+ T细胞耗竭和与ICB在肿瘤治疗中协同作用新靶

2024/03/13 15:38

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子宫内膜癌（EC）是发达国家中最常见的妇科癌症，每年全球有417,000例新诊断。2013年，美国TCGA项目提出了关于子宫内膜癌的TCGA分型，分为了4个亚型。其中，MMRd也被称为微卫星不稳定（MSI）EC，被认为是一个“免疫热”的肿瘤亚型，具有高突变负荷和活跃的免疫微环境。免疫检查点阻断(ICB)疗法在微卫星不稳定性(MSI)子宫内膜癌(EC)治疗中显示出临床疗效，其关键机制是逆转T细胞耗竭和恢复抗肿瘤免疫。

但部分患者仍表现出原发性耐药。因此，迫切需要找到可靠的生物标志物来选择适合抗PD-1疗法的患者，并寻找联合疗法的治疗靶点。

2023年8月10日，山东大学齐鲁医院孔北华教授团队在Cell Reports上发表题为“Targeting TCF19 sensitizes MSI endometrial cancer to anti-PD-1 therapy by alleviating CD8+ T cell exhaustion via TRIM14-IFN-b axis”的文章。

文章证明了转录因子19(TCF19)是癌症基因组图谱(TCGA)-EC队列中MSI和微卫星稳定(MSS)患者之间最具有显著差异表达的基因之一，与不良预后和免疫衰竭特征有关。TCF19在MSI EC中显著升高，进而促进三重基序14(TRIM14)转录，并与TANK结合激酶1(TBK1)-干扰素调节因子3(IRF3)-干扰素b(IFN-b)途径的过度激活信号有关。TCF19-TRIM14轴在非免疫学背景下促进肿瘤的发生，而干扰素-b的下游分泌增加通过细胞分化重编程促进CD8+T细胞的耗竭。最后，使用人源化模型展示，TCF19抑制和ICB疗法的组合显示出更有效的抗肿瘤反应。总的来说，本文研究表明，靶向TCF19是缓解CD8+ T细胞耗竭和与ICB在肿瘤治疗中协同作用的有效策略。

实验部分

本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统MSI EC患者子宫内膜癌的TMA样本进行多色免疫荧光图像采集。文章作者选择多重免疫荧光（mIHC）对TMA芯片进行染色后，借助Tissue Cytometry技术，对每个TMA芯片点中，每个细胞的核面积、每个细胞面积、每个细胞的表达强度以及细胞在不同微环境中密度分布进行了精准定量分析。

首先，根据DAPI染色信号、核大小和形状对细胞核进行了设门圈选，然后在有核细胞中筛选出CD8阳性细胞，这些细胞的CD8染色信号强度超过阈值（根据阴性对照和数据分布设置）。之后，根据强度阈值确定了每个表位阳性细胞在CD8阳性细胞中的比例。确认每个算法都能成功识别阳性细胞，就将其用于生成所有TMA点的目标标记/CD8+ T细胞的阳性百分比，以保持一致性。

对于从体内模型中切除的肿瘤的浸润PD-1+ CD8+ T细胞耗竭的定量，进行mIHC染色，在每个肿瘤切片中随机选择了三个高倍视野，统计了PD-1+ CD8+细胞中Ki-67+、TOX+、GranzymeB+ (GZMB+)、IFN-g+和TNF-a+细胞的百分比进行分析。

Panel : DAPI、PanCK、CD8、PD-1、TTM-3、LAG-3

Figure 1 TCF19在MSI EC患者中的高表达与CD8+T细胞的高耗竭水平相关

(K) MSI EC在的多色免疫荧光染色TMA样本：DAPI(蓝色)、PanCK(青色)、CD8(白色)、PD-1(黄色)、TTM-3(绿色)和LAG-3(红色)。

(L) MIHC染色后，扫描25个MSI EC TMA斑点，定量分析CD8+细胞中PD-1+、TIM-3+和LAG-3+细胞的百分比，并比较低TCF19组(n=17)和高TCF19组(n=8)之间的差异。

Figure 2 TCF19促进体内肿瘤形成和肿瘤浸润性CD8+T细胞的耗竭

(N) （O）MIHC分析Ki-67+/PD-1+CD8+TIL比例。

Figure 3 在人源化CDX和PDX模型中，TCF19抑制和PD-1阻断有效地逆转CD8+T细胞耗竭和阻止肿瘤发展

(E)-(G) MIHC检测人源化CDX模型切除肿瘤中PD-1+CD8+T细胞功能。(E)TOX+或GZMB+细胞/PD-1+CD8+T细胞的定量分析。

本文核心是围绕TCF19与CD8 +T细胞的关系，通过临床样本及人源化实验动物为对象开展了研究。作者为了评估CD8+T细胞的耗竭状态，以及对TCF19影响下PD-1和CD8+T细胞的表达情况，在文章关键数据的验证上使用了Tissue Cytometry技术。

在肿瘤免疫相关研究中，由于肿瘤微环境的存在，评估CD8耗竭不但有数量关系的变化，更重要的是所处的微环境位置。单纯通过流式细胞技术、单细胞测序技术虽然可以获得目标细胞群体表达量的变化，但是无法准确判断其在特定部位的富集程度，以及无法有力验证是否目标细胞群体与肿瘤存在空间上的相互作用。TG公司的Tissue Cytometry技术不但可以通过多重免疫荧光染色mIHC，对组织切片中单个细胞进行精准量化分析（包括单细胞标记蛋白形态），还可以通过精准的单细胞空间距离分析来校验目标细胞的微环境分布水平及其与肿瘤的空间作用关系。

作为mIHC单细胞定量分析技术的优势还在于，在单张切片上的细胞关系是可视化的明确指标，可以作为终极验证手段之一；而常规使用传统的连续切片进行免疫组化染色，以及利用不同算法在生物信息学领域进行数据分析中提取细胞互作水平，更多的是通过“推断“来进行数据产出，尚需借助其他技术进行印证。Tissue Cytometry技术拥有包括多重免疫荧光染色试剂盒在内的肿瘤微环境整体解决方案，可以在一张切片样本中最多标记10色荧光，并结合精准的光谱拆分技术、单细胞分割技术以及空间微环境可视化分析技术，在mIHC定量分析领域实现了业内领先水平，对于数据精准校验的应用需求，给出了一份完美的答卷。

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