OJIP叶绿素荧光快速诱导曲线测量技术

OJIP叶绿素荧光快速诱导曲线测量技术最新研究进展

——从单点测量到二维成像测量

叶绿素荧光测量技术是目前植物/藻类光系统功能、光合电子传递相关研究中不可或缺的重要技术，同时也广泛用于作物抗逆育种等研究中。叶绿素荧光技术有三种主要测量技术路线：PAM荧光淬灭动力学曲线、OJIP快速荧光诱导曲线和QA-再氧化动力学曲线分析，分别对应光系统运行机理的不同方面。

OJIP快速荧光诱导曲线测量要求对样品经过暗适应后的最小荧光上升到最大荧光这一过程进行快速检测。这一个过程一般在1-2秒即可完成，仪器检测器的最高灵敏度要求达到100 000次/秒以上。OJIP快速荧光动力学曲线部分参数及其意义： Fo、Fj、Fi、P或Fm、Vj、Vi、Mo、Area 、Fix Area、Sm 、Ss 、N（QA还原周转数量）、Phi_Po 、Psi_o 、Phi_Eo、Phi_Do、Phi_pav、ABS/RC（单位反应中心的吸收光量子通量）、TRo/RC（单位反应中心初始捕获光量子通量）、ETo/RC（单位反应中心初始电子传递光量子通量）、DIo/RC（单位反应中心能量散失）、ABS/CS（单位样品截面的吸收光量子通量）、TRo/CSo、RC/CSx（反应中心密度）、PI_ABS（基于吸收光量子通量的“性能”指数或称生存指数）、PIcs（基于截面的“性能”指数或称生存指数）等。

现在应用最广的OJIP快速荧光诱导曲线测量仪器主要为FluorPen和Handy PEA叶绿素荧光仪。伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校G. Govindjee教授与印度贾瓦哈拉尔尼赫鲁大学合作，比较这两种仪器的OJIP曲线测量结果，以此分析影响OJIP曲线测量的因素。这一研究得到了光合研究权威Hartmut K. Lichtenthaler教授的建议指导，发表于2021年《Photosynthetica》。

文章中还特别指出，2019年捷克科学院Küpper教授与PSI公司合作，首次将超高灵敏度成像传感器与FluorCam叶绿素荧光成像技术结合，实现了OJIP快速荧光诱导曲线的直接测量成像测量。将OJIP测量从传统荧光仪的单点测量，扩展到对整个叶片乃至整株植物的二维整体测量。比起非成像测量，这一最新的荧光成像技术能够评价测量参数的异质性、发现叶片上或大或小的渐变梯度，从而对植物受胁迫程度和发展做出更加准确的评估。同时，文章进一步指出，推荐使用叶绿素荧光成像技术还由于成像技术能够测量真实的光系统II量子产额。

目前，使用这一革新性的叶绿素荧光成像技术已经进行了大量关于重金属对光合作用抑制机理的研究。赫尔辛基大学等则利用这一新技术开展了拟南芥光系统对臭氧的响应机制等一系列研究。

通过对两种仪器对拟南芥OJIP曲线的测量结果分析，他们认为有三个因素会造成OJIP曲线测量结果的差异：

1. 原初荧光Fo的估测时间点：20μs、50μs或推测的时间零点；

2. 测量OJIP的饱和脉冲光强：100%、80%、50%、30%和20%光强，同时两种仪器的100%光强也有差异，FluorPen约为3120 ± 87 µmol(photons) m^–2 s^–1，而Handy PEA只能达到2890 ± 70µmol(photons) m^–2 s^–1。

3. 由于测量光源波长造成的叶片吸收率差异：FluorPen为470nm蓝光，Handy PEA为650nm红光，而470nm蓝光具有更高的叶片吸收率。

通过比较OJIP曲线计算的Fv/Fp（即最大光化学效率Fv/Fm）可以发现：在不同光强下，FluorPen测量得到的Fv/Fp均高于0.8（0.823 ± 0.0018至0.837 ± 0.0016），而Handy PEA测得的Fv/Fp则有很大一部分低于0.8（0.793 ± 0.003至0.812±0.0016），尤其在饱和脉冲光强较低时尤为严重。对于Fv/Fm的数值范围，虽然不同文献中有所差别，但对于未受胁迫、生长良好的高等植物，普遍共识Fv/Fm要高于0.8，最高点应能达到0.83-0.84。由此可见Handy PEA的数据结果有低估Fv/Fm的问题。

文章中还特别指出，2019年捷克科学院Küpper教授与PSI公司合作，首次将超高灵敏度成像传感器与FluorCam叶绿素荧光成像技术结合，实现了OJIP快速荧光诱导曲线的直接测量成像测量。将OJIP测量从传统荧光仪的单点测量，扩展到对整个叶片乃至整株植物的二维整体测量。比起非成像测量，这一最新的荧光成像技术能够评价测量参数的异质性、发现叶片上或大或小的渐变梯度，从而对植物受胁迫程度和发展做出更加准确的评估。同时，文章进一步指出，推荐使用叶绿素荧光成像技术还由于成像技术能够测量真实的光系统II量子产额。

目前，使用这一革新性的叶绿素荧光成像技术已经进行了大量关于重金属对光合作用抑制机理的研究。赫尔辛基大学等则利用这一新技术开展了拟南芥光系统对臭氧的响应机制等一系列研究。

参考文献：

1.Padhi B, et al. 2021. A comparison of chlorophyll fluorescence transient measurements, using Handy PEA and FluorPen fluorometers. Photosynthetica 59 : 39-48,

2.Küpper H, et al. 2019. Analysis of OJIP Chlorophyll Fluorescence Kinetics and QA Reoxidation Kinetics by Direct Fast Imaging. Plant Physiology 179: 369-381

3.Morales LO, et al. 2021. Ozone responses in Arabidopsis: beyond stomatal conductance. Plant Physiology 186(1): 180-192

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