FluorCam叶绿素荧光成像技术在药用植物研究中的应用

FluorCam叶绿素荧光成像技术在药用植物研究中的应用

FluorCam叶绿素荧光成像技术是目前最权威、使用最广、种类最全面、发表论文最多的叶绿素荧光成像技术，广泛应用于植物和作物的光合生理、表型成像分析、胁迫与抗性检测、病害检测研究、遗传育种、生理生态学、初级代谢与次级代谢研究、污染生态学研究检测/生物检测等研究。

中国是中草药的发源地，大约有12000种药用植物。其中很多药用植物在世界范围内有广泛分布，有些在国外传统医学和现代医学中也有应用。药用植物同样是FluorCam叶绿素荧光成像技术的重要研究对象。本文将介绍一些FluorCam叶绿素荧光成像技术的国内外药用植物研究案例。

一、 药用植物光合表型、抗逆及种植技术研究

1. 冻害的热成像和叶绿素荧光成像同步观测

    奥地利因斯布鲁克大学研究了千里光、香樟等的冻害响应。红外热成像测量反映了冻害扩散过程中造成叶片温度变化的过程，而FluorCam叶绿素荧光成像则反映了冻害扩散对光合系统的损害。结果显示，千里光叶片温度变化是同步的，但其叶尖的光合系统会先受到伤害。而香樟则观察到叶片的一种斑驳冻结模式。这反映了这两个物种对冻害的不同响应方式。 

参考文献：Hacker, J., Spindelböck, J. P. & Neuner, G. 2008. Mesophyll freezing and effects of freeze dehydration visualized by simultaneous measurement of IDTA and differential imaging chlorophyll fluorescence. Plant, Cell & Environment 31, 1725 – 1733

2. 盐胁迫的耐受机制

浙江农科院和浙江大学合作研究秋葵的盐胁迫耐受机制。叶绿素荧光参数最大光化学效率Fv/Fm作为检测植物受胁迫程度最灵敏的无损指标之一，已经得到了广泛的验证和认可。在这一研究中，Fv/Fm成像图作为重要的数据，反映盐胁迫对光系统的损害程度。 

参考文献：Yu C, et al. 2019. The Phosphoproteomic Response of Okra (Abelmoschus esculentus L.) Seedlings to Salt Stress. Int. J. Mol. Sci. 20(6): 1262 

3. 调控培养光质促进光合和生长

韩国国立忠北大学使用红绿蓝（RGB）三色LED光源模拟了三种单色光和不同配比红蓝/红绿蓝混色光的光照培养条件，研究不同培养光质对黄瓜假还阳参生长的影响。FluorCam叶绿素荧光成像分析表明，蓝光显著提高了非光化学淬灭系数NPQ，而红光和绿光则降低了NPQ。红绿蓝三色光中蓝光比例提高会造成NPQ上升，红光比例提高则会使电子传递速率ETR上升。同时，红绿蓝三色光培养时，茎生物量、叶面积等形态学指标要优于单色光和红蓝光。综合结果，R8G1B1的光照比例被认为是最优的培养光照比例。这为相关的药用植物大规模人工培养提供了理论依据和培养方案。 

参考文献：Park SY, et al. 2020. Manipulating light quality to promote shoot growth and bioactive compound biosynthesis of Crepidiastrum denticulatum (Houtt.) Pak & Kawano cultivated in plant factories. Journal of Applied Research on Medicinal and Aromatic Plants 16: 100237

二、 药用植物加工与品质鉴定

1. 最佳干燥温度的筛选

米兰理工大学研究了牛至叶片在不同温度下（50°C，55°C，60°C）的通风干燥过程。传统方法是通过检测叶片水分含量变化来确定叶片是否达到要求。但仅靠水分含量，是无法确定叶片是否已经真正失活。如果叶片实际还没有完全失活，那么在储存和运输过程中很可能会有有效成分减少、霉变等问题。而通过FluorCam叶绿素荧光技术测量的最大光化学效率Fv/Fm可以非常简便直观地反映叶片活性。经过暗适应处理后，生长良好的C3植物叶片Fv/Fm约为0.83-0.84。在受到胁迫后，这一数值会随着胁迫程度的加剧而线型降低。当Fv/Fm低于0.1时，叶片已经处于完全失活的状态。通过叶绿素荧光成像图分析，结合有效活性成分——总多酚量分析，研究得到了最佳的干燥温度，确定了后续的进一步加工处理方法。 

参考文献：Bravin R, 2017, Effect of drying temperature on selected product parameter of oregano and downstream cold atmospheric pressure plasma processing for microbial inactivation, Politecnico Di Milano, Master Thesis

2. 次生代谢总体水平 

中草药的有效成分主要来源于植物次生代谢所产生的一系列复杂化合物，比如多酚、黄酮等。要分析这些次生代谢化合物一般都是使用高效液相色谱或是其他化学分析方法。这些分析方法虽然高效准确，但很多时候只能分析一种或者几种特定化合物，难以衡量植物总体的次生代谢水平。同时由于需要对植物样品进行破坏性处理，因此无法进行次生代谢的长期动态测量，也不能提供次生代谢在植物不同部位分布的相关信息。

而最近几年逐渐成熟的UV-MCF多光谱荧光成像技术通过检测UV紫外光激发的植物多光谱荧光（Multi-color Fluorescence，MCF），可以获得包括苯丙素类：黄酮醇（如杨梅酮-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷）、羟基肉桂酸（如咖啡酸）等[Montero, 2016]；植保素、多酚、黄酮类、阿魏酸[Castillo-Lizardo, 2015; Pérez-Bueno, 2016]等一系列次生代谢的总体水平数据。这一技术与叶绿素荧光成像技术结合，已经广泛应用于胁迫造成的次生代谢响应研究中，如西班牙科学研究委员会研究了烟草在感染细菌性甘薯茎腐病菌后光合能力与次生代谢的变化、中国农科院烟草研究所对烟草干旱抗性的次生代谢研究。 

而通过药用植物次生代谢总体水平研究来快速检测其有效成分的相对含量，无疑是这一技术未来的重要应用方向。目前国际上开展的工作如通过向日葵次生代谢变化检测列当的早期接种；高光与紫外光培养对积雪草黄酮类化合物含量影响等。在可以预期的未来，这一技术将成为药用植物研究的重要工具之一。

参考文献：

l Pérez-Bueno M L, et al. 2016. Temporal and Spatial Resolution of Activated Plant Defense Responses in Leaves of Nicotiana benthamiana Infected with Dickeya dadantii. Front Plant Sci. 6: 1209

l Khan R, et al. 2019. Transcriptome Profiling, Biochemical and Physiological Analyses Provide New Insights towards Drought Tolerance in Nicotiana tabacum L. Genes 10: 1041

l Ortiz-Bustos CM, et al. 2016. Fluorescence Imaging in the Red and Far-Red Region during Growth of Sunflower Plantlets. Diagnosis of the Early Infection by the Parasite Orobanche cumana. Front. Plant Sci. 7:884

l Müller V, et al. 2016. Ecologically relevant UV-B dose combined with high PAR intensity distinctly affect plant growth and accumulation of secondary metabolites in leaves of Centella asiatica L. Urban. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology 127: 161–169

三、 药用植物提取物开发生物农药

波兰农业大学尝试从葛缕子和薄荷中提取香精油来开发生态友好的植物性除草剂。他们将不同浓度的精油乳液施加到玉米和典型的玉米杂草稗子上。通过FluorCam叶绿素荧光成像分析，可以直观地获得玉米和稗子光合系统的损伤数据，从而评估精油的除草效果。结果显示，2.5%浓度的葛缕子香精油效果最好。它可以在对玉米光合能力不造成显著影响的情况下，明显地损伤稗子的光合系统，从而达到抑制杂草生长同时不对作物造成伤害的目的。这为生物农药的进一步开发和商业化推广提供了理论依据。 

参考文献：Synowiec A, et al. 2019. Carum carvi L. essential oil: A promising candidate for botanical herbicide against Echinochloa crus-galli (L.) P. Beauv. in maize cultivation. Industrial Crops & Products 140: 111652 

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