IBA-蛋白质表达和纯化系统填料-Strep-Tactin Sepharose

                              Strep-Tactin® Sepharose®

　　Strep-Tactin Sepharose提供高结合容量和最低的非特异结合（见下图），可用于重力流纯化。由于Strep-Tactin树脂经过优化适于柱亲和层析，而不适于批量纯化，因此推荐使用预装的Strep-Tactin Sepharose柱。该纯化柱有多种形式，从0.2 ml迷你柱到10 ml柱。


Strep-Tactin Sepharose树脂技术指标：
Strep-Tactin浓度： 5 mg/ml 沉积树脂
结合容量： 1 ml沉积树脂可一步法纯化50-100 nmol 重组蛋白(多达3 mg 30 KDa蛋白质)
支持介质： Sepharose 4FF, 4 % agarose
珠子大小 45 - 165 µm
线性流动速率： 重力流
排阻极限： 3 x 107 Da
形式： 50 % 悬浮在100 mM Tris/HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl
稳定性： 室温运输后能保存至少6个月
保存： 4 °C，不能冻存
运输： 室温

                          Strep-tag® / Strep-Tactin®蛋白质表达与纯化系统

　　作为后基因组时代表达克隆和蛋白质纯化技术最重要的供应商之一，德国IBA公司开发了一个称为Strep-tag的通用技术平台。这种快速、合算、多样性地生产和使用重组蛋白的技术平台是IBA与TU Munich的Arne Skerra博士教授密切合作开发而成。除了围绕Strep-tag的大型产品组合外，IBA还独家提供应用该技术的蛋白质生产定制服务。

　　Strep-tag技术开发的原理是众所周知的生物素（biotin）和抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）之间的结合反应。为了将这种牢固的相互作用用于蛋白质纯化用途，研究者们发现需要一个肽，该肽与重组蛋白质融合后，能够结合在streptavidin的生物素结合口袋，从而作为纯化tag。最后研究者们成功设计出一个只由8个氨基酸(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)构成的短序列并称之为Strep-tag II。为了优化结合属性，streptavidin也被设计成为Strep-Tactin。如此，一对优化的结合伙伴被发现了：Strep-tag / Strep-Tactin系统现已成为最被广泛应用的亲和层析系统之一。

　　Strep-Tactin与多种不同的基质偶联，使Strep-tag融合蛋白得以在生理条件下亲和纯化。与其他tag相比，这些温和的纯化参数能保存蛋白质的生物活性，并仅经一步层析后即可产出超过99%的纯度。

        Strep-tag®系统可用于从任何表达系统包括杆状病毒、哺乳动物细胞、酵母和细菌中纯化Strep-tag II蛋白。用于细菌、哺乳动物细胞和酵母的表达载体请参见本栏目相关章节。

　　除了表达载体，IBA还提供围绕Strep-tag用于蛋白质纯化、检测、分析（蛋白质固定）、蛋白质：蛋白质相互作用研究以及高通量纯化的完整的产品组合。

      The tag 技术 蛋白质
      仅8个氨基酸
     平衡的氨基酸组成 – 对蛋白质的结构和活性一般没有影响
     高选择性和易于控制的结合属性
     C-或N-末端融合 
     无需去除 有效和通用的表达载体，标准化的克隆策略
     生理条件下的亲和层析
     通过颜色改变可见柱再生和活性状态（见下）
     可获得超过99%的纯度 Strep-tag适用于：
     金属蛋白
     膜蛋白
     具有多个亚单位的敏感蛋白质复合体
     以及其他任何蛋白质



    结合：
    GFP Strep-tag 蛋白结合于Strep-Tactin 洗脱： 
    用脱硫生物素 再生（颜色控制）： 
    开始去除脱硫生物素 再生：
    脱硫生物素被完全除去 再生：
    用平衡缓冲液快速再生


    纯化在E. coli 中过度表达的GFP-Strep-tag II 融合蛋白
    图片(从左至右)：

     1、GFP-Strep-tag II融合蛋白特异结合在Strep-Tactin SepharoseÒ柱上，而非特异性蛋白质被少量生理性洗涤缓冲液迅速洗去。

     2、由于加入特异性竞争剂脱硫生物素，Strep-tag蛋白被洗脱。3-5、柱再生：脱硫生物素被黄色溶液HABA取代，后者一旦与Strep-Tactin复合即变为红色。HABA随后被洗涤缓冲液除去，柱子可被重新使用。

   怎样获得优良无比的纯化因素
　　Strep-tag® 纯化系统是基于Strep-tag II肽和特殊设计的Strep-Tactin（streptavidin的变体）之间高选择性和极易控制的相互作用而建立起来的蛋白纯化系统。Strep-tag II对Strep-Tactin的结合亲和力比对streptavidin高将近100倍。在亲和纯化过程中，附了tag的蛋白质结合在被固定了的Strep-Tactin上。生理缓冲液如PBS可与一系列添加剂一起用于该纯化过程。短暂的洗涤步骤之后，在同一缓冲液中加入脱硫生物素（2.5 mM）即可将纯化的重组蛋白温和地洗脱下来。脱硫生物素是一种便宜的、可逆结合的、稳定的生物素类似物，而生物素是streptavidin的天然配体。这种竞争性洗脱是赋予特异性的第二步，从而得到优良无比的纯化因素。该系统安全、易于使用；纯化柱再生和活性状态可以通过纯化柱上的颜色改变来观察到。

　　Strep-tag融合蛋白可以经Western blots, ELISA, 电子或荧光显微镜进行方便的检测。有相应的Strep-Tactin酶共轭物和抗Strep-tag II的单克隆抗体供出售。

        Strep-tag®II对蛋白质的影响可以忽略
　　此8个氨基酸的短肽tag由于具有化学平衡的氨基酸组成（WSHPQFEK），因此对重组蛋白的影响可以忽略不计。该tag可以被置于C-端或N-端。建议在蛋白和tag之间加入2个氨基酸的间隔以确保tag的可接近性。总的来说，该tag不干扰蛋白质的折叠或生物活性、不与重金属离子缓冲液杂质反应、无离子交换属性、不会诱导蛋白质聚集。因此无需去除该tag。

        Strep-Tactin®：长效的亲和柱
　　Strep-Tactin是streptavidin的一种衍生物，是已知最稳定的蛋白质之一。Streptavidin对以8 M urea或guanidine, 0.5 M NaOH以及50 % formamide (t = 1 h; T = 37 °C)的处理保持稳定。蛋白酶(胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶和弹性蛋白酶等) 在1:50 w/w比例下，37 °C孵育2小时都无法切割 streptavidin。当SDS存在时，仅在温度高于60 °C时，streptavidin才开始降解成单体。经过测试，Strep-Tactin已经被证实具有上述作为长效亲和柱必备的卓越特性，可被重复使用3-5次。而且，Strep-Tactin的中性PI值使非特异性蛋白质或核酸的结合降到最低。

        Strep-Tactin树脂技术指标

　　有5种版本Strep-Tactin树脂，区别在于其特性和应用。Strep-Tactin Sepharose®优先用于重力流层析；Strep-Tactin Superflow®和Strep-Tactin MacroPrep® 也可用于低压力或FPLC；Strep-Tactin POROS® (20和50)用于FPLC和HPLC层析。每个基质都会表现出不同的非特异性结合性质，当使用某种基质由于非特异性背景而无法获得满意结果时，建议换用其它的基质（亦请见Strep-Tactin Column Evaluation Sets）。此外Superflow尤其适用于增加的流速，也适用于大的蛋白质复合物的纯化。
　　请注意，Strep-Tactin树脂被优化用于柱亲和层析，而不适用于批量纯化。批量纯化请使用IBA的MagStrep Strep-Tactin包被的磁珠。

表1: 与Strep-tag/Strep-Tactin相互作用兼容的试剂

    试剂 浓度
Reduction Agents
DTT 50 mM
β-mercaptoethanol 50 mM
Non-Ionic Detergents
C8E4 Octyltetraoxyethylene 最高0.88 %
C10E5; Decylpentaoxyethylene 0.12 %
C10 E6 0.03 %
C12 E8 0.005 %
C12E9; Dodecyl nonaoxyethylene (Thesit) 0.023 %
DM; Decyl-β-D-maltoside 0.35 %
LM; N-dodecyl β-D-maltoside 0.007 %
NG; N-nonyl-β-D-glucopyranoside 0.2 %
OG; N-octyl-β-D-glucopyranoside 2.34 %
TX; Triton X-100 2 %
Tween 20 2 %
Ionic Detergents
N-lauryl-sarcosine 2 %
8-HESO;N-octyl-2-hydroxy-ethylsulfoxide 1,32 %
SDS; Sodium-N-dodecyl sulfate 0.1 %
Zwitter-Ionic Detergents
CHAPS 0.1 %
DDAO; N-decyl-N,N-dimethylamine-N-oxide 0.034 %
LDAO; N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide 0.13 %
其它
Ammonium sulfate (NH4)2SO4 2 M
CaCl2 最高1 M
Ethanol 10%
EDTA 50 mM
Guanidine 最高1 M
Glycerol 最高25 %
Imidazole 最高250 mM
MgCl2 1 M
NaCl 5 M
Urea 最高1 M

注意：这些试剂在高达上述浓度下已成功用于纯化如GAPDH-Strep-tagÒ。未标注“最高”的试剂，也许可以使用更高浓度。由于结合依赖于Strep-tag在特殊蛋白质中的空间可及性，所给的浓度值对于其他蛋白质可能有偏差。

提供高结合容量和最低的非特异结合（见下图），可用于重力流纯化。由于Strep-Tactin树脂经过优化适于柱亲和层析，而不适于批量纯化，因此推荐使用预装的Strep-Tactin Sepharose柱。该纯化柱有多种形式，从0.2 ml迷你柱到10 ml柱。