高效液相色谱法+调味品+黄曲霉毒素B1

调味品中黄曲霉毒素的B₁的检测解决方案

关键字：

黄曲霉B₁、全自动免疫亲和柱操作仪、调味品、高效液相色谱法

介绍：

调味品在人类饮食生活中占据着重要的地位，其按照工艺可分为发酵型调味品、香辛料调味品、复合调味品等。目前对于调味品最大的食品安全问题在于原料的使用，源于主要原料可能被真菌毒素污染的情况，日常调味品中也可能含有致命的真菌毒素。我国国家标准GB2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量标准》中，对酱油、醋以及酿造酱中的黄曲霉B₁有明确的限量要求，为5ppb。目前我国国家标准中对其他调味料产品的相关真菌毒素暂无限量要求，但世界卫生组织、美国FDA及欧盟法规等对调味品中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等均有限量要求。美国食品法典委员会（CAC）还特别发布《预防和降低调味品中真菌毒素操作规范》，以通过建立调味品供应链良好操作规范，将调味品中可能产生的真菌毒素控制在最低水平，实现预防和降低调味品中真菌毒素控制目标。

本文依据GB5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》的第三法，试样经纯甲醇或者纯乙腈提取，提取液经离心稀释后，使用全自动免疫亲和柱操作仪净化，使用全自动标液配制仪配制标准曲线，进样高效液相色谱检测。结果为常见调味品酱油和醋中黄曲霉毒素B₁的加标回收率在89%-100%之间，相对标准偏差小于5%。

1. 仪器与耗材

Pribolab^®ASSP-100 全自动标液配制仪

Pribolab^®Auto IPS-6060自动化免疫亲和操作仪

PriboFast^®KRC光化学柱后衍生器

PriboFast^®玻璃纤维滤纸

Pribolab^®黄曲霉毒素免疫亲和柱

Pribolab^®黄曲霉毒素B₁标准品

Pribolab^®真菌毒素专用C₁₈色谱柱

高效液相色谱：岛津20AT

2. 标准曲线的配制

使用Pribolab ASSP-100 全自动标液配制仪，以甲醇为溶剂，配制浓度为0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL的黄曲霉毒素B₁标准工作液。

3. 分析步骤

3.1. 样品制备

调味品酱油和醋的采样量需大于1 L，对于袋装、瓶装等包装样品需至少采集3个包装（同一批次或号），样品在一个容器中用匀浆机混匀后，其中任意的100g（mL）样品进行检测。

3.2. 样品提取

称取5g试样(精确至0.01g )于 50mL 离心管中,用甲醇定容至25mL（精确至0.1mL )，涡旋混匀，置于超声波/涡旋振荡器或摇床中振荡 20min （或用均质器均质3min ），在 6000r / min下离心10min （或均质后玻璃纤维滤纸过滤），取上清液备用。

3.3. 样品提取液稀释

准确移取 4mL上清液，加入 23mL 1% 吐温-20 的PBS，混匀。

4. 样品净化

将上述液体置于离心管中，放入Pribolab Auto IPS-6060自动化免疫亲和操作仪的样品槽，IPS会全自动完成定量上样、富集、洗涤、洗脱过程。根据程序设置，IPS会将上述液体全部吸入过柱，10 mL PBS、10 mL蒸馏水洗涤，最后2 mL色谱甲醇洗脱，过滤膜后液相色谱分析。

5. 液相条件

流 动 相：甲醇：水=45:55等度洗脱          液相：岛津-荧光检测器

流    速：1 mL/min                        压力：15.6 Mpa；     

进 样 量：20ul                            柱温：室温   

检测波长：360nm 450nm                    Pribolab色谱柱：C₁₈

在线柱后衍生：PriboFast® KRC光化学柱后衍生器

    黄曲霉毒素B₁柱后光化学衍生法色谱图

6. 样品分析

选取市场上现售的三种酱油品牌和食醋品牌进行样品加标检测，按照上述实验步骤操作，样品加标回收率见下表：

7. 结果与讨论

市面上在售的品牌酱油和食醋大都为黄曲霉B₁阴性样品，样品加标回收率稳定。当加标水平为0.2ppb，在仪器方法定量限附近时加标回收率略偏低；当加标水平成倍扩大后，样品加标回收率稳定在90%以上。本次验证使用PriboFast^®玻璃纤维滤纸能够达到快速初步净化的目的。在使用Pribolab^® Auto IPS-6060自动化免疫亲和操作仪自动上样淋洗的时，使用PBS-T洗涤样品可以有效地去除干扰色素等杂质，使样品更加纯净。

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