南京科捷高效液相色谱仪原理、临床应用及常见故障处理

【科捷仪器】

由于高效液相色谱系统在医学界的用户越来越多，了解高效液相色谱技术和仪器装置及工作原理很有必要。南京科捷在本文中简述高效液相色谱技术的系统组成、工作原理、临床应用及常见故障处理。

1   高效液相色谱法(High Perfor mance Liquid Chrom atograph Y HPLC)

    随着医学科学技术的发展，要求分离出入体中某种特定化合物，并给予定性分析和定量测定。色谱技术是一种常用的分离技术，它的分离原理是基于混合物中各组分在经过一个由固定相和流动相组成的体系时，由于各组分在化学性质上的差异，在两相中具有不同的分配系数，两相作相对运动时，被分析的混合组分随流动相一起运动，并在两相中进行多次的吸附和分配，使得那些分配系数只有很小差别的组分。在移动速度上产生很大差别，从而使各组分得到分离。通俗地说流动相就是带动样品在色谱柱里流动的物质，它相当于溶剂，固定相就是填充在柱子里的物质，它相当于吸附剂。每种固定相都具有不同的性质。

    流动相是气体的叫气相色谱。流动相是液体的就叫液相色谱。气相色谱法具有快速，分离效率高。用样量少等特点，但要求样品能够汽化。从而受到样品的挥发性限制。

    高效液相色谱法(HPLC)是由现代高压技术与传统的液相色谱方法相结合，加上高效柱填充物和高灵敏检测器所发展起来的新型分离分析技术。由于它只要求样品能制成溶液，而不需要汽化，因此不受样品挥发性的约束。对于挥发性低，热稳定性差，分子量大的高分子化合物以及离子型化合物尤为有利。如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、脂类、维生素、抗生素等分子量较大。沸点较高的合成药物以及无机盐类。所以说HPLC具有适用范围广、分离效率高、速度快、流动相可选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流出组分容易收集等优点。

    不同种类的柱可以进行不同类型的液相色谱分离，也产生了不同的液相色谱法。如正向色谱、反向色谱、离子对色谱、离子交换色谱、凝胶色谱等。

2  高效液相色谱系统及工作原理

    高效液相色谱系统流程如图1所示

图1高效液相色谱系统流程图

    由流程图可看出系统是由储液器，泵，进样器，分离柱，检测器，数据处理系统等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入进样系统或进样器。样品通过进样器以精确的体积插入流动相中。再被流动相带到柱内，分离过程在柱内进行，被分离成单个组分的样品依次从柱内流出，通过检测器样品浓度被转变成电信号送到记录器和数据系统，经系统处理。数据以图谱和图表形式打印出来。

3  高效液相色谱仪在医院临床中的应用

    HPLC技术主要应用是在临床药学和临床生理学中。临床药学主要是治疗药物监测(TDM)和药代动力学。HPLC之所以在TDM中占有重要地位。其主要原因是：

    (1)可以同时监测不同种类的药物。

    (2)一次进样可同时分析原药及代谢产物。

    (3)分离和定量同时进行．具有较高的准确性和精确度。此外HPLC还具有最佳的经济效益比，花费远远低于其它传统方法。目前用HPLC分析临床常用药物超过数百种。已广泛用于TDM中的如抗癫痫药，抗心律失常药。茶碱．扑热息痛，环孢霉索等。在临床生理研究方面，许多复杂化合物或内源代谢物也可用HPLC法分析。如血中儿茶酚胺、氨基酸、激素、前列腺素、多肽、核酸等。
此外HPLC还可应用到临床诊断中，如在新生儿疾病筛查中，开发了血红蛋白病的Hb，苯丙酮尿酸症的PKU，成神经细胞瘤等方法。

    需要注意的是临床样品都是生物样品，如血、尿、痰、体液等，成分复杂，性质各异，生物大分子多，必须进行适当的处理，去除某些干扰物。处理时严格按要求去做，否则会导致实验失败或造成柱的阻塞，甚至报废。

4  高效液相色谱仪常见故障处理

    故障l  系统压力不稳，噪音增加，色谱图上出现毛刺。

    原因  管道中吸入空气，溶人流动相中的空气．泵垫圈磨损引起的泄漏，微粒污染单向阀均可引起上述症状。

    处理工作中注意观察流动相的量，保证不锈钢滤器(沉子)沉人储液器瓶底，避免吸入空气。流动相要充分脱气。泵垫圈是系统中最易磨损的部件，泵垫圈的磨损易造成高压下的压力不稳，并会由泵头渗出流动相，一旦发现立即换上新垫圈，有条件的应定期更换泵垫圈。上述问题解决后泵仍不能正常工作，考虑单向阀的微粒污染问题。小心地拆下单向阀，放入10％的硝酸溶液中超声清洗15分钟．再反复用色谱级水清洗数遍，最后用甲醇清洗两次，用洗耳球由进液方向反吸气，如不通气说明故障已排除，装上单向阀即可。

    故障2  柱压高。

    原因  一是样品沉积在柱内，二是柱内滤片阻塞。

    处理  对第一种情况，可用能溶解所测样品的溶剂冲洗，冲洗时拆开柱与检测器之间的接头，正向冲洗，或将柱出口接在泵上反向冲洗。注意不要让冲洗液通过检测器流动池，避免流动池污染。冲洗30分钟后接上检测器。若冲洗不见效，考虑第二种情况，更换柱头滤片。

    故障3  出峰不佳，峰分叉(双峰)。

    原因  柱头填料塌陷。

    处理  拧开柱头，取出滤片，检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料)，装入新填料，滴一滴甲醇，填料下陷．再填，用与柱内径相同的顶端平面光滑的不锈钢杆压紧，再填平，滴甲醇。再压紧反复几次，直至装满填平。擦干净柱外壁的填料，加上新滤片，拧紧柱头，接上泵冲洗，用流动相冲洗30分钟后再接检测器。

    故障4  换柱后出现峰肩。

    原因  柱安装位置不佳。

    处理  松开柱，轻轻转动一角度，重新安装上紧，100%甲醇冲洗30分钟即可。

    故障5  峰面积改变。

    原因  加样针不到位。

    处理检查加样针是否插到底．保证针到位。实际工作中碰到的问题很多，日常保养很重要。如储液器的清洁，流动相的脱气，每天用后系统中的缓冲液要冲洗干净。先用蒸馏水冲洗15分钟，然后用甲醇冲洗，防止无机盐沉积造成系统内的磨损和阻塞，这些都可以减少故障的发生。另外对HPLC技术及设备原理的了解也非常重要，这样就能够提高仪器的利用率，更好地发挥仪器作用。

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