抗体纯化产品解决方案

抗体纯化产品解决方案

蛋白纯化系统——酶标仪

制备出效价高，特异性强，稳定性好的抗体是免疫学实验取得成功的基础，抗体质量的好坏直接影响着研究者研究的成败，不同的免疫学实验方法（如ELISA，IHC，IP，ICC,SDS-PAGE, WB等）对抗体的效价，浓度和纯度有不同的要求。我们知道，一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体，血清蛋白以及其他各种杂蛋白等，在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后，我们所制备的抗体的纯度关键取决于所选择的纯化方法。

一、 抗体简介

抗体属于免疫球蛋白，免疫球蛋白都有一个共同的组成，既有两条类似重链和两条轻链，结构示意图见图1。

图1 典型的H2L2抗体结构以及Fab片段和F(ab)₂片段结构

根据重链的不同，免疫球蛋白可以分为5个类型，轻链也有2个不同的类型，具体见下表。

表1 免疫球蛋白的类型

二、 分离提取抗体时常用的缓冲液和添加剂

三、 样品前处理

抗体培养物可能来源于人类血清、杂交瘤细胞悬浮培养物、微生物（最常见是大肠杆菌），因此首先进行细胞破碎（胞内重组表达），如果是胞外产物，这一步可以忽略。

再进行固液分离（离心或者超滤），如果抗体是包含体的话，在这一步可以考虑增加稀释复性这一步骤，如果觉得稀释复性的得率低，可以把复性这一步移至色谱分离步骤里面，进行柱复性。另外在这一步骤里，还需添加右旋葡糖酐和氯化钙或者固体PVP，用来沉淀除去脂质和脂蛋白，它们会堵塞柱子。以及可以通过脱盐柱或者硫酸铵分级沉淀，除去小分子杂质。

最后再进行微滤。微滤的目的是除去一些更小的颗粒物质，防止其堵塞柱子。

上海闪谱针对这一步骤中所需的仪器——如离心机、超声破碎仪等等正在紧张研制中，不久将陆续推向市场，与客户们见面。

四、纯化策略

1、如果采用脱盐除去小分子

   我们推荐使用上海闪谱的Clear-First系列蛋白纯化系统（图2），以及各填料公司生产的脱盐柱（该系列蛋白纯化系统与市场上所有的蛋白纯化柱均匹配）结合起来，完成脱盐这个步骤。典型的脱盐色谱图3如下所示：

图2 上海闪谱Clear-First系列蛋白纯化系统中的一款，Clear-First-2000型

图3 典型的脱盐色谱图

2、如果采用硫酸铵分级沉淀除去小分子

在这一步得到的蛋白沉淀，除了可以按照前述方法进行脱盐之外，还可以考虑接下来可以使用HIC色谱分离。

3、抗体纯化

（1）第一步——亲和色谱

Protein A和Protein G是从Streptococci和Staphylococcus aureus分离的细菌蛋白，它们可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A和protein G 作为配基可以被偶联到琼脂糖凝胶上，当抗体培养物从中流过时，特异性的IgG就与配基结合，其他杂蛋白则穿流而过。因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同，我们需要具体情况具体对待，分别选择protein A 或者protein G,或者是protein A/protein G组合。一般推荐小鼠单抗IgG2a，IgG2b，IgG3，兔，人，猪的多克隆抗体用protein A纯化，而小鼠单抗IgG1, 大鼠单抗，小鼠，大鼠，山羊的多克隆抗体则选择用protein G纯化。

另外，蛋白质L对Igs的X轻链具有高亲和力，可纯化完整抗体和抗体的片段。因此，可用其对IgM和Fab及F(ab)₂片段进行纯化。除了这些特性，我们还发现纯化结果不稳定，并且其半衰期短。但是，蛋白质L是一种替代型“广谱”抗体纯化基质。蛋白质L与免疫球蛋白的K轻链结合，这对于纯化抗体片段及完整的IgG、IgM和IgA很有用。

我们推荐使用上海闪谱的Clear-First系列蛋白纯化系统（图2），以及各填料公司生产的G蛋白或A蛋白柱（该系列蛋白纯化系统与市场上所有的蛋白纯化柱均匹配）结合起来，完成亲和色谱这个步骤。典型的亲和色谱图4如下所示：

图4 利用蛋白G填料柱纯化Fab片段

（2）第二步——离子交换色谱、亲和色谱或疏水作用色谱（如果需要）

这一步主要目的是去除特异性杂蛋白，如白蛋白、铁传递蛋白等，我们推荐使用上海闪谱的Clear-First系列蛋白纯化系统（图2），以及各填料公司生产的离子交换、亲和、疏水作用柱（该系列蛋白纯化系统与市场上所有的蛋白纯化柱均匹配）结合起来，完成这个步骤。典型的去杂如图5如下所示：

图5 利用Blue Sepharose除去白蛋白

（3）第三步——凝胶过滤色谱

抗体在制备过程中，经常会聚合成二聚体或者多聚体，这些多聚体会显著降低抗体的生物学活性。我们推荐使用上海闪谱的Clear-First系列蛋白纯化系统（图2），以及各填料公司生产的高分辨率分子筛柱（该系列蛋白纯化系统与市场上所有的蛋白纯化柱均匹配）结合起来，完成这个步骤。典型的去杂如图6如下所示：

图6 利用Superdex 200/10 300 GL去除二聚体和多聚体

五、抗体的检测

根据蛋白纯化系统软件上的出峰位置，从自动收集架上有选择性的选取部分样品管进行SDS-PAGE（蛋白电泳）验证，考马斯亮蓝染色，观察条带的分子量大小与抗体分子是否吻合，观察是否还有其他的杂带，若有杂带，估测下所需蛋白的含量，一般超过90%就不需要进一步的纯化，只需要进行脱盐处理即可（有时可能还需要切掉标签蛋白部分）。若想对所得蛋白进行更进一步的验证，Western blot，将蛋白转至NC膜上，用标签抗体或该蛋白的特异性单抗进行孵育，清洗后，再孵育上带有HRP的二抗，再一次清洗后，就可以将NC膜放进化学发光成像系统中，再讲混合好的A、B液滴在膜上，就可以用化学发光成像系统进行拍摄，观察产生条带（斑点）位置，浓淡等，从而进一步验证蛋白的正确性。

得到纯的蛋白后，最后一般都要进行浓度的测定，现在最普及的是用BCA试剂盒测定，按操作说明加好孵育后，用酶标仪（上海闪谱生物，ReadMax 1900全波长光吸收酶标仪，见图7）在562 nm处读取OD值，在通过酶标仪上的结果处理，即可计算得出待测蛋白的浓度，无需人员通过EXCEL自己计算。这样就基本完成了蛋白分离纯化的整个过程。

最后酶免疫分析，如ELISA，是免疫分析的主要部分。理解了ELISA的实验原理，就可以理解其他以抗原-抗体反应为基础的实验原理。ELISA方法能检测任何给定抗体的特异性、亲和性、浓度及灵敏性。下面是一个进行直接或间接ELISA的典型的操作步骤。直接与间接ELISA的操作步骤基本是相同的。不同之处是与目标配体相结合的一抗是否是酶标抗体。在直接分析中，一抗是酶标抗体；在间接分析中，一抗不是酶标抗体，酶标记在识别一抗的二抗上。

图7上海闪谱生物ReadMax 1900全波长光吸收酶标仪

ELISA实验的典型操作步骤：

(1) 在进行分析前，应首先建立酶标板每孔的加样策略。永远要设立空白孔作为阴性对照。例如，如果打算对血清或者培养上清进行抗体浓度滴定，我们常常是仅在奇数孔包被抗原，而如果是进行杂交瘤的阳性筛选，除了一个或者两个孔留作空白对照外，我们将整块板包被抗原。

(2) 进行分析前最好过夜包被酶标板。这样，目标配体便有足够的时间与孔结合。孔板的包被可以放置在4℃，最长时间可达2周。用包被缓冲液稀释配体至2〜5μg/mL。每个孔用0. 1ml的稀释配体进行包被。

(3) 进行分析时，从冰箱里拿出包被板。倒掉孔中的液体，用洗涤缓冲液洗整块孔板3次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(4) 向所有孔中加 300 μL的封闭缓冲液。将孔板于室温静置至少30 min，然后用洗漆缓冲液洗孔板一次。

(5) 在封闭孔板的同时，用PBS稀释一抗。如果是筛选抗血清，我们通常进行 5 倍的倍比稀释，起始点为 1: 50或 1 : 100。如要检测培养上清，进行2倍的倍比稀释可能是适当的。如果是检测杂交瘤培养上清，不要做任何的稀释。

(6) 如果一抗是酶标抗体，可将其进行 1 : 100〜1 : 10000稀释。可对几个稀释度的抗体进行测定。

(7) 向孔中加人 100W稀释的抗体。对于系列稀释的抗体，最好每个稀释度加双份孔（一共4个孔）。37℃孵育孔板 30min。

(8) 孵育后，用洗涤缓冲液洗板 3 次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(9) 如果向孔板加入的是酶标一抗，越过此步而直接进行步骤10。 间接分析中，向所有的孔中加人 100 μL稀释的酶标二抗。30℃ 孵育孔板30 min。

(10) 用洗涤缓冲液洗孔板 5次。每次洗涤后要在滤纸上扣干残留液体。

(11) 向所有的孔中加入100 μL的TMB底物。观察颜色的变化。让颜色反应到阴性对照显示轻微的颜色。这种现象未必会发生。如果不发生，5〜10 min后终止反应。

(12) 用 50：1 的终止液终止反应。

(13) 在酶标仪上以适当的吸光波长读取孔板颜色强度的数值。TMB底物自身的背景读数为450nmol/L。数值越大，抗体越多。

六、经济上的考虑：

除了上述方法，还有其他方法也可以用于抗体纯化，包括聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG) 吸附、羟基磷灰石色谱法（hydroxyapatite chromatography) 和疏水作用色谱法(hydrophobic interaction chromatography)。

抗体的最终用途将决定其被纯化的方法。对于快速廉价的纯化，沉淀法是足够的。如果用于诊断，蛋白质A/G 纯化的抗体能提供好的检测结果的重复性。如果用于临床前期研究，蛋白质A/G 纯化的抗体再用IEC、SEC 或者疏水作用色谱法进一步纯化将得到高度纯化的抗体。对于任何临床前期和临床应用，抗体纯化必须在无菌和低内毒素的条件下进行，必须符合当地（如食品和药物管理部门）的法定操作程序。因此，对于每个实验室 ，每种抗体应该确定一种纯化策略。