载脂蛋白（ApoE）是一种糖蛋白，包括299个氨基酸，在身体调节胆固醇水平上起主要作用。胆固醇水平过高是冠心病的主要因素，在美国，冠心病是引起死亡的主要因素。ApoE与老年痴呆症也有关系，这种病是因为大脑额叶萎缩，造成神经衰弱。老年痴呆症的普遍表现是痴呆，而且是不能治愈、退化、终端的。ApoE基因有两个SNPs，位于密码子112（c.388 T>C）和158（c.526 C>T）。密码子112和158组合的基因型翻译3种不同类型的蛋白质，通常称为：ε3（正常），ε2（异常），和ε4（异常）。

为了促进斑马鱼的高通量的基因分型，我们开发了一种新的技术——用高通量熔解分析（HRMA）区分野生、杂合、纯合突变。这种耗时一个小时的技术不需要进行限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳的操作。此技术生成的熔解图的敏感性高，可以检测不明确的PCR产物。我们可以对斑马鱼的三种类型的突变进行可靠的基因分型，包括apchu745（apcmcr）和p53zy7 （p531166T ），小的缺失突变（bap28y75）及逆转录病毒的插入突变（wdr43hi821a）。这种技术可对单个斑马鱼胚胎及个体进行基因分型并适用于其它类型的生物体。Developmental Dynamics 238:3168-3174，2009©2009 Wiley-Liss，Inc。 关键词：熔解曲线 斑马鱼 基因分型 SNP 点突变 插入突变

摘 要 应用复合PCR结合变性高效液相色谱（DHPLC）技术，通过通用增菌培养，建立动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌的快速高通量检测方法。根据沙门氏菌和志贺氏菌特异基因序列分别设计特异性引物，复合PCR扩增的产物经DHPLC技术进行快速检测。以49株参考菌株做特异性试验，并开展了精密度检测试验。试验结果表明，该方法具有很好的特异性和精密度，经通用增菌和复合PCR-DHPLC技术可同时检测饲料中的沙门氏菌和志贺氏菌。该方法可以快速、准确、高通量检测，是动物源性饲料中致病菌高通量检测的新技术。 关键词 DHPLC；动物源性饲料；通用增菌；沙门氏菌；志贺氏菌

摘要： 背景：用于基因分型的高分辨率熔解曲线技术既简单又有效。在以熔解为基础的方法中，探针法是基因分型的黄金标准，可以将等位基因与目标的匹配完全区分开。小片段基因分型法是代替探针的基因分型法。异源双链核酸分子的存在使得检测纯合子变得容易，其熔解峰的形状有明显的改变。纯合子G/C或A/T的基因分型比较困难，因为其等位基因的Tm值相似。这些碱基对改变的纯合子用小片段法很难区分。样品间的温度、buffer和体积的变化限制纯合子的分离。不管仪器是多么精确，用户操作的变化是需要注意的，减少这种变化的方法可以改进小片段基因分型。利用内部特定反应的标准可以克服这些限制。 方法：合成校准的核苷酸，与其互补链的浓度相同。用普通PCR仪进行PCR反应，反应时有LC Green和内标的存在。PCR反应之后，将其放入LightSanner中，扫描55℃-97℃范围内的数据。标准品熔解的特征是成一条线的，用于转换每个样品的荧光数据。测序之后确认基因型。我们通过测量每个样品的峰形与基因型一致的平均Tm值的距离，评估较正之前和之后纯合子基因分型的错误率。 当样品的Tm值与不正确分组平均Tm值相近时，可以观测到错误。 如需要全文请下载或者登录北京思博全公司网站获取http://www.spectron.com.cn

RET原癌基因单个碱基的突变可以引发多发性内分泌腺瘤2型。RET突变传统的基因分型方法是外显子测序。一种闭管操作的基因分型方法已经成熟，此方法用的是一种饱和DNA染料，非标记探针及高分辨率熔解扩增子分析。此方法需要两个连续的聚合酶链式反应阶段，主要的和第二次实验。主要的实验共用7个反应和8个非标记探针分析RET基因外显子10、11、13、14和16 。主要实验基因分型了野生型外显子，外显子13普通的多态性，外显子16的一个突变及其它检测到的序列变化。主要非标记探针数据限制检测到的RET基因序列突变的基因分型，这些突变位点的基因分型在第二次实验的2-5个反应中进行。设计6条探针，所用方法是：用遮蔽技术和遮蔽选择的序列变化使探针下其它位置的突变的分析变得明确。这两步RET基因分型之后，少于实验0.2%的外显子需要测序确定基因型。对5个野生型和29个可用的RET序列突变样品（与测序结果100%一致）做盲研究。用非标记探针和遮蔽技术进行高分辨率熔解分析是快速、精确的基因分型方法，>50的RET序列突变可以进行基因分型。 多发性内分泌腺瘤2型（MEN2）综合症，MEN2A，MEN2B及家族性甲状腺髓样癌由生殖细胞系RET基因外显子10、11、13和16的突变引发。MEN2综合症是常染色体显性秩序失调引起的高生命危险的甲状腺癌。RET突变的遗传学检测可以确认处于甲状腺癌危险中但是没有爆发癌症的病人，此时切除甲状腺可以增加存活的机率。 之前有许多实验方法检测或基因分型RET突变，比如说单链构象多态性，变性梯度凝胶电泳，温度梯度毛细管电泳，限制性内切酶消化PCR产物，焦磷酸测序，荧光标记杂交探针及微卫星。但是，这些方法中的大多数需要PCR反应之后的操作来检测突变。其中一些方法报道突变检测的敏感性为95%或少于95%，或者仅实验了RET突变样品的一小部分。这些方法分析RET序列变化的限制范围，可能只以普通突变为目标而错过了稀有突变。此外，不致病多态性的存在可以导致异常的结果。因为这些限制，RET外显子测序保持黄金标准。 测序是一种耗时且昂贵的开管实验，需要生成PCR产物之后的额外操作。相反，高分辨率熔解曲线的突变扫描分析是一种快速且便宜的闭管操作实验，不需要进行PCR产物之后的额外操作。通过用一种饱和DNA染料：LC Green，高分辨率熔解曲线分析可以检测PCR扩增子之内的序列变化。对检测PCR扩增子内杂合点突变的高分辨率熔解技术的系统研究发现，检测400bp之内的扩增子的敏感性和特异性是100%。最近，我们证实用高分辨率熔解分析进行RET外显子突变扫描。虽然这种方法在盲实验中检测100%的突变，但是有些罕见的突变的熔解曲线相似，完全进行基因分型是困难的，在这种情况下，在最初的突变扫描之后需要测序。另一种方法，添加杂交探针可以分出RET突变的绝大多数的基因型，而不需要测序。 荧光标记杂交探针分析是一种快速、闭管操作的实验，可以通过探针/等位基因的熔解温度基因分型序列变化，但是需要昂贵的寡核苷酸修饰。非标记探针也可以通过Tm的不同进行基因分型，也是一种闭管操作的实验，需要LC Green染料。因为用DNA饱和染料检测，非标记探针和扩增数据可以从一个熔解曲线分析。Zhou等最近证实非标记探针基因分型分析可以补充突变扫描。但是，在同一个外显子之内的RET所有突变不能只用一条探针进行基因分型，因为探针下特定突变的熔解温度相似或相同。 为了完成闭管基因分型实验，发明了两步RET基因分型方法，此方法比测序技术成本低，耗时少。用于扩增熔解的第一个PCR阶段（主要实验），扫描RET外显子的序列变化，反之，非标记探针分析位于突变范围内，且分辨可能的基因型。第二个PCR阶段（第二次实验）需要限定数目的特定突变的探针对>50的RET序列突变进行明确的基因分型。用遮蔽技术设计的探针简化了突变分离。当探针下有多重的可能的序列突变使分析变得复杂时，遮蔽技术简化了探针熔解的判断。在多态位点选择含有错配的（缺失、不匹配碱基或一般碱基）可以遮蔽的序列变化。这样的话就在遮蔽多态位点人为的创造了一个与可能的等位基因的错配。野生型与遮蔽突变的等位基因都有一个与探针错配的碱基和相似的Tm。然而，突变等位基因在探针下其它的位置有一个额外的错配，可以通过比仅在遮蔽位置变化的等位基因稍低的Tm值鉴定。

摘要： Vogelstein和Kinzler（美国国家科学院院刊，1999年）第一次描述了Digital PCR（dPCR）的概念，一种在微量细胞群中（如原发性肿瘤组织）鉴定突变的方法。通过稀释样品DNA到一个单个分子水平，它可以把PCR自然模拟指数转化为数字信号。当PCR成功的扩增出这些单个分子,产物可以通过对观察到的预期的体细胞纯合突变峰进行测序分析，而不是典型测序反应中的被遮盖在背景杂峰中的少量低峰。通过扩增足够多的单个分子的扩增产物, 基于观察到的突变体与全部的成功扩增产物的比，微量突变体可以被鉴定出。 方法： 我们采用一种加入HRM使用的改良dPCR方法，通过特殊的HRM曲线图在原发性肿瘤样本中发现低含量的突变部分。 数字PCR要求以单个DNA分子作为扩增模板，从而使末端检测变为数字读出而不是模拟的DNA混合物。为了应用HRM，需要获得更多的扩增产物，来得到更加可靠的HRM曲线图组，因此我们选择了五不同的稀释浓度。 这些稀释样本是基于后续的灵敏度接近于20%的测序手段去检测微量突变体. HRM表现出高敏感性,下至2-5%的突变体都可被检出。因此，一个单一突变基因的复制足以在溶解曲线图中发现他们的差异.

癌症中体细胞分子层面的突变，常常需要在大量野生型DNA中辨识低浓度的DNA突变。但是，突变检测方法的选择率和灵敏度常常限制了鉴定低浓度突变的可靠性。最近开发的COLD-PCR（低变性温度下的复合扩增，李等人。2008）解决了低含量基因突变检测的一些局限性，在PCR扩增过程中利用关键变性温度丰富含有突变的扩增子，不论突变位于序列的什么地方。COLD-PCR的一个主要属性是富集突变体以便于在PCR后的直接测序。然而碱基测序仍然是昂贵的选择，从而通过高通量扫描序列预检是有吸引力的办法。高分辨率融解（HRM）是一种可用于预筛查测序之前未知突变的技术，但不能确定具体的检测基因突变的身份。因此，为了富集、快速筛查和鉴定低浓度的未知突变，我们把HRM突变扫描和COLD-PCR相结合，随后进行已知突变的直接测序鉴定。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传CpG二核苷酸修饰形式，异常的DNA甲基化模式发生在许多基因启动子的CpG岛，这会增加患癌症的风险。CpG岛高甲基化常导致基因沉默，与癌症、老化、基因印记、X-染色体失活密切相关，此外，全基因组CpG高甲基化中也证实了发生在肿瘤形成的早期。传统的检测甲基化位点的方法是通过重亚硫酸盐处理，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后进行直接测序。甲基化的胞嘧啶没有发生改变，因此通过测序很容易识别。本研究中我们系统的评价了通过LightScanner的高分辨溶解曲线检测甲基化的可靠性。如果这种方法在检测甲基化中是可靠且灵敏度高，就可以减少测序的繁琐过程。 未处理的和经过SssI处理的pBluescript II SK(+)质粒用Qiagen EpiTect试剂盒进行重亚硫酸盐。通过对有代表性的区域进行测序，确保样品完全甲基化以及亚硫酸盐处理。引物设计在扩增片段大小在79-216bp的含有1-8个CpG位点的7个不同的片段。100%甲基化的和未甲基化的样品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的样品可以明显的区分开。当两个样品按以上比例混合后，熔解曲线表现出重复的剂量放映关系，当50%混合时与未甲基化的标准品偏性最大。高分辨溶解曲线的灵敏度足够检测甲基化位点，对小片段的灵敏度可达到2%,大片段的可以10%。 重要的DNA甲基化位点显示在B淋巴细胞增生性疾病，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）中。瘤抑制基因的外部沉默可以通过DNA甲基化抑制剂处理而发生转变。本研究中，CLL患者的miR-195基因CpG岛上游甲基化位点用Vidaza或Cladribine处理，重亚硫酸盐处理的CpG甲基化变化的最高的进行PCR扩增，之后用LightScanner进行高分辨溶解曲线分析。样品经亚硫酸盐处理后有不同的的胞嘧啶的转换，然后通过单独和混合后分析检测的灵敏性。不同克隆之间只要有意个被保留的C就可以在异源或同源混合的样品中区分开。这一结果证实了高分辨熔解曲线是检测甲基化位点的简单且灵敏度高的方法。

应用高分辨率熔解曲线技术进行基因分型不仅简单而且有效。基于熔解曲线的分析方法中，探针法是进行基因分型的金标准，能够全面的检测匹配的目的等位基因。小片段扩增法是一种不需要设计探针进行基因分型的方法。由于异源双链的存在，杂合子很容易检测，而这很大程度上改变熔解转化的峰形。纯合子基因分型中G/C或A/T的改变是最难检测的，因为它们的等位基因有相似的Tm值。那些称为中性纯合子的碱基对使用小片段法是很难区分。此外，纯合子难区分也受样品与样品间温度的变化，缓冲液和体积的限制。无论多么精确的仪器，相关的变化可能是显著的，所以需要一种方法来减少这种变化并且改善小片段基因分型。而使用特异性内标就可以克服这些限制

高分辨熔解曲线分析技术在农业领域中的应用 高分辨熔解曲线分析技术（High Resolution Melting Curves Analysis）是近年来发展起来的一种检测基因突变和刷选SNP的新方法。这种方法也可以与标记和非标记探针结合对已知位点的突变和SNP进行检测以及用于SSR（STR）等短串联重复分子标记分析。 该技术已经被大规模应用于医学领域中，用来分析和筛选导致人类疾病的基因的突变研究。一系列的研究证明，高分辨熔解曲线分析技术是筛选SNP和进行基因分型工作的迅速、廉价而有效的方法。 目前，高分辨熔解曲线分析技术开始越来越多的被应用在农业领域的研究中，并且取得不少成绩。其中比较有代表性的研究单位有英国洛桑农业试验站、中国科学院发育与遗传研究所、中国农业科学院植物保护研究所、中国林业研究院热带林业研究所等。 下面，简单介绍一下高分辨熔解曲线在农业领域中的应用。 小麦是世界上普遍种植的粮食作物，对人类的可持续发展有重要的影响。英国环境、食品和农业事务部小麦遗传改良工作组(Defra Wheat Genetic Improvement Network)与英国洛桑农业试验站合作建立了采用高分辨熔解曲线进行基因突变分析的研究平台。研究者采用化学诱变剂甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)对春小麦进行诱变，然后采用高分辨熔解曲线分析的方法(LightScanner™ 系统和LCGreen Plus染料)对处理后的样品进行扫描，证明这种方法在研究小片段的基因靶序列时有很高的灵敏度与成功率，并且在研究那些外显子较小而内含子很大的基因时特别有效。

最近，高分辨率熔解曲线法（High-resolution melting）作为一种可以在小的扩增子中来检测单核苷酸多态性基因型的技术被引进。这种基于封闭小管子的方法（包括快循环的PCR）可以在15分钟内完成，并且不需要采用荧光定量PCR仪、等位基因特异性PCR和荧光标记的寡聚核苷酸。该过程通过采用可以检测异源双链DNA的染料得以实现，这种染料在饱和的程度下也不会抑制PCR反应。野生型和纯合子的样品可以通过熔解温度( Tm)的迁移来区别。杂合子样品和纯合子样品可以通过被改变的曲线形状来更好的区分，而不是通过熔解温度。杂合子样品可以产生溶解温度较同源双链更低的异源双链。杂合子产生的被放大的熔解曲线包括2个同源双链和2个异源双链，会产生一个倾斜的复合的熔解曲线。这种熔解曲线在形状上可以很容易与纯合子的曲线加以区别。 然而，在一个扩增子中不同的杂合子是否可以通过不同曲线的形状被区分出来还不太清楚。根据扩增后产生的同源和异源双链的情况，可以将SNPs分为四种类别。不同类别的SNPs异源双链的错配是不同的，因此，如果仪器的分辨率足够有效的话，它们的熔解曲线是可以被区别的。并且，在同种类别中，不同的杂合子也是可以被区别出来。尽管这种错配是相同的，但是最相近的参数稳定性却依赖于相邻碱基的错配，因此，预测出来的稳定性常常是不同的。 我们从ARUP实验室中选取用来做标准临床基因型鉴定的HFE, V Leiden因子和II型多态因子的DNA样品，采用MagNa Pure instrument (Roche)的方法来抽提DNA，采用基于LightCycler的邻近杂交探针[adjacent hybridization probe(HybProbeTM)]的方法来确定基因型。采用探针融合分析基因型的一个优点就是可以用探针鉴定出除了预期改变的序列以为的改变。在ARUP实验室中进行常规的临床分析时，一旦在意外的温度下出现了异常的熔解峰时，样品就会通过进一步的测序来确定序列的改变。在预计的突变附近的一些杂合的序列突变就可以被这样鉴定出来。三个II型杂合子因子（all SNPs），四个V 杂合子 (2 SNPs, 1 个单碱基的缺失和 1 个复合的杂合子)和 6 HFE杂合子 (4 SNPs and 2复合杂合子)可被用来做比较。在选择和完全鉴定样品之后，通过ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.)来确定DNA的浓度。如果可以的话，每个杂合子基因型的3个样品可以被处理。 如需要全文请下载或者登录北京思博全公司网站获取http://www.spectron.com.cn

高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。 HRM原理 HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。 在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。因此不能用于熔解曲线的检测。而LC Green是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。 HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。 图一：同源双链体和异源双链体的熔解曲线 图二：HRM数据处理过程 HRM的特点和应用 HRM应用： 检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁 鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变 基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失 特定突变、多态性位点的筛选 外显子和短扩增子基因型扫描 HRM特点： 灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。 特异性好：HRM的特异性可以达到90-100%。短的扩增子特异性要更高 不受碱基位点局限，适用范围广 在封闭的试管内进行，可降低污染操作简单、 成本低廉、时间少、误差小、高通量检测 检测的样品范围广：HRM检测片段范围在38-1000bp不同来源的样品都可以用于HRM如血粉、口腔细胞、冷冻的肿瘤样品、也可用于酒精固定、福尔马林固定或石蜡包埋的组织等，在人类遗传性疾病的研究中，通常用周边血液淋巴细胞中提取DNA，用于HRM分析。 HRM：实验设计中需要考虑的问题 高效的扩增方案的设计对于HRM的成功至关重要。最大的灵敏度和特异性有助于最佳的PCR结果的产生，同时扩增子的溶解特性对于结果也非常重要。这取决于引物的设计和引物的位置。 在实验结果中有时会出现假阳性，这时可以通过调整引物或者扩增参数避免出现假阴性的结果。 样品的质量对特异性有一定的影响，因此，进行HRM分析时要选用高质量的样品。 总结 HRM灵敏度高、特异性好 该方法是在封闭的试管内进行，可降低污染，因此，该技术具有操作简单、成本低廉、时间少、误差小、高通量检测的优点。是进行突变扫描的首选方法。

高分辨率熔解曲线分析甲基化研究应用 ——表观遗传学中检测CpG位点的一种新技术 甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-Hi-Res Melting®）是一种不需要PCR产物后续操作的，简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法主要通过比较曲线的熔解温度和峰形得以实现。该方法可以在一些列的CpG位点中检测出单一的一个甲基化的发生，同时，也可以对一系列的CpG位点的甲基化水平进行分析。 单个CpG位点的甲基化和平均的甲基化水平会对熔解曲线的形状造成影响。采用重亚硫酸盐处理DNA模板可以使5-甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶。在PCR反应中，尿嘧啶可以与腺嘌呤配对，最终使得胞嘧啶转化成胸腺嘧啶。样品中的GC含量发生了变化，最终被转化成了熔解曲线Tm值之间的差异。CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响，因此，Tm值和熔解峰的形状可以被用在表观遗传学的研究中。 对于甲基化研究中一些常见的问题，我们采用了有三种方法来克服。1，采用商品化的试剂来减少复制过程中的碱基转变之间的差异；2，重亚硫酸盐处理过的DNA会迅速的降解，我们的结果证明样品在4°C下可在TE缓冲液中保存几个月；3，采用内部的熔解温度校正，尽量减少样品之间的差异。 示例：我们扩增了一个含有5个CpG位点的miRNA-195基因片段。发现采用高分辨率的仪器LightScanner和饱和染料LCGreen Plus适用于检测的甲基化水平从10%到100%，并且当一段基因的甲基化水平在39%和40%之间时，仪器也能区分出细微的熔解曲线之间的差异。通过实验有如下发现：1，小的复制片段的Tm值随着甲基化水平的增加而增加；2，采用内部的校正可以改善Tm值和平均甲基化之间的相关性；3，异源二聚体含量的增加能够扩大衍生熔解峰形状之间的差异，并且采用商品化的试剂盒可以延长经重亚硫酸盐处理过的DNA样品的保存时间；4，荧光定量PCR的检测证明模板有较好的稳定性。 图1，用于研究的材料中的甲基化平均水平的分布情况。miRNA-195基因的小扩增片段中含有的5个CpG位点被用来做研究。平均的甲基化水平通过测序得到的相对C:T峰的高度来估算。图中的颜色代表不同的样品，在下面的图中也采用同样的标准。 图2，甲基化水平的不同导致的Tm值之间的差异。通过校正可以加强甲基化水平和Tm值之间的相关性。在上面的两幅图中，图A是没有校正的衍生熔解峰，图B是观测到的Tm值和平均的甲基化水平之间的相关性。在下面的两幅图中，图C是校正过的衍生熔解峰，图D是观测到的Tm值和平均的甲基化水平之间的相关性。通过校正，数据之间的相关性得到了改善。平均的甲基化水平如下：粉色（100%），深绿色（40%），浅绿色（40%），橘黄色（39%），深蓝色（10%），浅蓝色（8%）。注意：橘黄色的样品的相对位置在校正过以后和绿色样品的Tm值更为接近（图C所示），这和测序得到的结果是吻合的。 图3，未进行校正的一些肿瘤样品和过作为对照的过甲基化样品的衍生熔解峰。152bp miRNA-195小扩增片段5个CpG位点的平均甲基化水平如下：粉色（100%），深绿色（40%），浅绿色（40%），深蓝色（10%）。如在上图A中所示，代表过甲基化样品的粉色峰和低甲基化样品的深蓝色峰形状上都更尖锐，可以由样品中存在很少的异源双链的含量来解释。深绿色和浅绿色峰形的差异可能是由于在2，4，5的甲基化位点上的甲基化位点特异性所引起的。

采用快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探针的高分辨率熔解曲线进行突变体等位基因的偏向性扩增 简介： 高分辨率熔解曲线可以通过扫描PCR的扩增片断来检测杂合体中基因序列的变化。该方法在检测小于400bp的PCR片断时灵敏度可达99%以上。该方法自开发以来，被不断的应用于新的领域，如采用小片段扩增法和非标记的探针（LunaProbes）对已知序列进行基因分型。 最近，一种基于快速循环荧光定量PCR仪和LightScanner32上的非标记探针的高分辨率熔解曲线分析，进行突变体等位基因的偏向性扩增的方法被开发的了出来。该方法可以在野生型等位基因的背景下检测出突变率小于5%的等位基因的突变。 原理： 采用双链DNA的饱和燃料LCGreen Plus和非标记的探针（LunaProbes）熔解温度的不同（Tm值）来区分不同的基因型。 根据要分析的等位基因，设计出一种可以与之结合的非标记的探针（LunaProbes）。该探针的3’ 端被封闭，以防止PCR过程中的扩增。突变的等位基因的偏向性扩增主要是通过设定PCR反应的退火温度来实现的。这种温度介于完全互补的探针（野生型位点）Tm值和非完全互补的探针（突变体的位点）Tm值之间。在该退火温度下，完全互补的探针和目标DNA链仍然结合在一起，因而抑制野生型序列的PCR反应，从而实现突变体等位基因的偏向性扩增。 示例： LunaProbes与野生型基因之间的Tm值为62ºC，与突变体基因之间的Tm值为54ºC，因而采用58ºC作为退火温度来进行突变的等位基因的偏向性扩增。 图 1. LunaProbes的标准化差异峰. 野生型的等位基因位点（灰色）= 62ºC突变型的等位基因位点（红色）= 54ºC。58ºC作为退火温度来进行50–50的混合样品（黄色）的突变等位基因的差异性扩增。这种扩增方法使得差异扩增的分辨率达到10倍，并且使得检测的灵敏性到0.7–1.5%