high resolution melting HRM 高分辨率熔解曲线分析甲基化研究应用

高分辨率熔解曲线分析甲基化研究应用 ——表观遗传学中检测CpG位点的一种新技术 甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-Hi-Res Melting®）是一种不需要PCR产物后续操作的，简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法主要通过比较曲线的熔解温度和峰形得以实现。该方法可以在一些列的CpG位点中检测出单一的一个甲基化的发生，同时，也可以对一系列的CpG位点的甲基化水平进行分析。 单个CpG位点的甲基化和平均的甲基化水平会对熔解曲线的形状造成影响。采用重亚硫酸盐处理DNA模板可以使5-甲基胞嘧啶转化为尿嘧啶。在PCR反应中，尿嘧啶可以与腺嘌呤配对，最终使得胞嘧啶转化成胸腺嘧啶。样品中的GC含量发生了变化，最终被转化成了熔解曲线Tm值之间的差异。CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响，因此，Tm值和熔解峰的形状可以被用在表观遗传学的研究中。 对于甲基化研究中一些常见的问题，我们采用了有三种方法来克服。1，采用商品化的试剂来减少复制过程中的碱基转变之间的差异；2，重亚硫酸盐处理过的DNA会迅速的降解，我们的结果证明样品在4°C下可在TE缓冲液中保存几个月；3，采用内部的熔解温度校正，尽量减少样品之间的差异。 示例：我们扩增了一个含有5个CpG位点的miRNA-195基因片段。发现采用高分辨率的仪器LightScanner和饱和染料LCGreen Plus适用于检测的甲基化水平从10%到100%，并且当一段基因的甲基化水平在39%和40%之间时，仪器也能区分出细微的熔解曲线之间的差异。通过实验有如下发现：1，小的复制片段的Tm值随着甲基化水平的增加而增加；2，采用内部的校正可以改善Tm值和平均甲基化之间的相关性；3，异源二聚体含量的增加能够扩大衍生熔解峰形状之间的差异，并且采用商品化的试剂盒可以延长经重亚硫酸盐处理过的DNA样品的保存时间；4，荧光定量PCR的检测证明模板有较好的稳定性。 图1，用于研究的材料中的甲基化平均水平的分布情况。miRNA-195基因的小扩增片段中含有的5个CpG位点被用来做研究。平均的甲基化水平通过测序得到的相对C:T峰的高度来估算。图中的颜色代表不同的样品，在下面的图中也采用同样的标准。 图2，甲基化水平的不同导致的Tm值之间的差异。通过校正可以加强甲基化水平和Tm值之间的相关性。在上面的两幅图中，图A是没有校正的衍生熔解峰，图B是观测到的Tm值和平均的甲基化水平之间的相关性。在下面的两幅图中，图C是校正过的衍生熔解峰，图D是观测到的Tm值和平均的甲基化水平之间的相关性。通过校正，数据之间的相关性得到了改善。平均的甲基化水平如下：粉色（100%），深绿色（40%），浅绿色（40%），橘黄色（39%），深蓝色（10%），浅蓝色（8%）。注意：橘黄色的样品的相对位置在校正过以后和绿色样品的Tm值更为接近（图C所示），这和测序得到的结果是吻合的。 图3，未进行校正的一些肿瘤样品和过作为对照的过甲基化样品的衍生熔解峰。152bp miRNA-195小扩增片段5个CpG位点的平均甲基化水平如下：粉色（100%），深绿色（40%），浅绿色（40%），深蓝色（10%）。如在上图A中所示，代表过甲基化样品的粉色峰和低甲基化样品的深蓝色峰形状上都更尖锐，可以由样品中存在很少的异源双链的含量来解释。深绿色和浅绿色峰形的差异可能是由于在2，4，5的甲基化位点上的甲基化位点特异性所引起的。