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一种快速有效的基因分型斑马鱼的方法

2011-05-17 10:09

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为了促进斑马鱼的高通量的基因分型,我们开发了一种新的技术——用高通量熔解分析(HRMA)区分野生、杂合、纯合突变。这种耗时一个小时的技术不需要进行限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳的操作。此技术生成的熔解图的敏感性高,可以检测不明确的PCR产物。我们可以对斑马鱼的三种类型的突变进行可靠的基因分型,包括apchu745(apcmcr)和p53zy7 (p531166T ),小的缺失突变(bap28y75)及逆转录病毒的插入突变(wdr43hi821a)。这种技术可对单个斑马鱼胚胎及个体进行基因分型并适用于其它类型的生物体。Developmental Dynamics 238:3168-3174,2009©2009 Wiley-Liss,Inc。 关键词:熔解曲线 斑马鱼 基因分型 SNP 点突变 插入突变

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低水平突变的检测促使了许多新方法的发展。我们结合现有的三个技术:数字PCR,非标记探针法和MAAB(突变等位基因的偏向性扩增)(见图1)。数字PCR(Vogelstein and Kinzler,1999)需要许多重复的样本使模板稀释至约1拷贝/反应。将原始的数字PCR进行一些改进后可以进行高分辨溶解曲线分析(HRM),要求模板稀释为5个拷贝/反应 (McKinney, 2007)。这表明,如果存在突变的等位基因,一个反应中至少包括20%的等位基因并且可以检测到异源双链的存在。通常数字PCR检测的灵敏度约为2%。并且灵敏度是可以增加的,这主要取决于重复检测的数量。非标记探针法在PCR反应中加入3’端封闭的非标记寡核苷酸(Zhou,2005)。在使用HRM仪器时除了进行扫描之外,非标记探针增加了基因分型的功能(见图2)。非标记探针的灵敏度大约在5%(Wall,2007)。MAAB利用非标记探针增加了稳定性,探针与野生型等位基因完全匹配,和突变的等位基因不完全匹配,使突变的等位基因得到优势扩增。MAAB的灵敏度可以低于1%(McKinney,2009)。本实验中,我们结合这三种方法来增加HRM的灵敏性和有效性。 如需要全文请下载或者登录北京思博全公司网站获取http://www.spectron.com.cn

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