数字PCR和高分辨率熔解法在肿瘤样本中发现微量突变体的应用

2010-12-17 09:28

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摘要： Vogelstein和Kinzler（美国国家科学院院刊，1999年）第一次描述了Digital PCR（dPCR）的概念，一种在微量细胞群中（如原发性肿瘤组织）鉴定突变的方法。通过稀释样品DNA到一个单个分子水平，它可以把PCR自然模拟指数转化为数字信号。当PCR成功的扩增出这些单个分子,产物可以通过对观察到的预期的体细胞纯合突变峰进行测序分析，而不是典型测序反应中的被遮盖在背景杂峰中的少量低峰。通过扩增足够多的单个分子的扩增产物, 基于观察到的突变体与全部的成功扩增产物的比，微量突变体可以被鉴定出。方法：我们采用一种加入HRM使用的改良dPCR方法，通过特殊的HRM曲线图在原发性肿瘤样本中发现低含量的突变部分。数字PCR要求以单个DNA分子作为扩增模板，从而使末端检测变为数字读出而不是模拟的DNA混合物。为了应用HRM，需要获得更多的扩增产物，来得到更加可靠的HRM曲线图组，因此我们选择了五不同的稀释浓度。这些稀释样本是基于后续的灵敏度接近于20%的测序手段去检测微量突变体. HRM表现出高敏感性,下至2-5%的突变体都可被检出。因此，一个单一突变基因的复制足以在溶解曲线图中发现他们的差异.

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