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IVT转录过程中NTPs和帽子类似物残留的检测

艾杰尔飞诺美

2024/09/06 15:33

阅读：2

【飞诺美色谱】

概述

目前，治疗用的mRNA是在T7聚合酶的作用下，以线性化的质粒为模板通过体外转录合成。转录后体系中可能存在转录相关的酶、DNA模板、核苷三磷酸(ntps)

底物、帽子类似物等杂质组分。对中控样品进行检测，

一方面可以优化补料的配比提高生产效率，另外一方面可以减少影响最终产品安全性的杂质生成。本实验采用高效液相色谱法，选择Biozen Oligo(1.7 µm, 2.1×100

mm)色谱柱建立一种可以同时分离4种NTP和帽子类似

物的高效液相色谱条件，该条件可以用于在mRNA体外转录过程中的NTPs和帽子类似物的残留进行定量检测。结果显示，Biozen Oligo可以满足分析要求。

本实验采用Biozen Oligo生物惰性硬件的核壳色谱柱对mRNA样品进行分析。主要考虑到两点：第一，

NTPs和帽子类似物含有高能磷酸键，非常容易跟不锈钢硬件产生路易斯酸碱作用从而造成吸附，引起峰拖尾和回收率低的问题。而Biozen系列色谱柱有钛内衬，可以抑制这种吸附作用；另外一方面，核壳柱和普通全多孔硅胶色谱柱相比，具有高柱效，高分离度，高灵敏度，低背压等特点。

关键词

NTPs 、帽子类似物、残留、生物惰性、Biozen Oligo

化合物信息

实验部分

3.1仪器、试剂与材料

3.1.1主要仪器设备

Thermo U3000 高效液相色谱； UV检测器

3.1.2试剂材料

三乙胺，己胺，磷酸为分析纯；甲醇为色谱纯；实验用水为屈臣氏蒸馏水。

NTPs和帽子类似物的样品为云舟生物提供，用无酶水稀释成混标，浓度分别为1mM。

Luciferase IVT mRNA 样品1和2为云舟生物提供，用无酶水稀释成约为1.2ug/uL。

*特别感谢云舟生物科技（广州）股份有限公司提供此次样品，云舟生物作为全球基因递送技术的创新型企业，提供基因递送方案的设计研发与优化，科研用载体定制（包括基因载体构建、质粒DNA 制备、病毒包装、CRISPR/shRNA文库构建、稳转细胞株构建、

mRNA体外转录、重组蛋白表达纯化等）全产业链服务。以其优异的产品和服务，为科研工作者以及相关企业提供了宝贵的支持。

3.2样品前处理方法

样品用无酶水稀释后上样。

3.3仪器检测条件

3.3.1色谱条件

色谱柱： Biozen Oligo (1.7 µm ，2.1 × 100 mm)； P/N: 00D-4791-AN

流动相： A：取400mL纯水，精密加入1.5mL磷酸混匀，再加入5mL三乙胺和200uL正己胺充分溶解，pH值约为7.2 .

B：甲醇

流速： 0.2mL/min；检测器： 260nm

柱温： 35℃;

进样量： 0.1µL

梯度：

3.4实验图谱

结论本实验建立的UHPLC的色谱条件，可以在25分钟内完成分析， NTPs 和帽子类似物分离度高。 Luciferase IVT mRNA 样品1和2的合成工艺路线有所差别，其中Luciferase IVT mRNA 样品2（粉色）中含有帽子类似物的残留，通过该色谱方法可以分离出来以便后续进行定量分析。该方法对于mRNA样品中几种目标杂质进行分离分析，峰形对称，分离度好，满足对分析精度和通量的要求。