【飞诺美色谱】液相色谱串联质谱法测定血清中20种类固醇激素

前言

类固醇激素是一类脂溶性小分子激素，是由胆固醇经一系列

酶催化而来，可分为肾上腺皮质激素和性激素两类，在维持机体

正常内分泌，调节性功能、机体发展、免疫调节及生育控制方面

有明确的作用。人体内类固醇激素的升高或者降低与一些临床疾

病，如，先天肾上腺增生、多囊卵巢综合症、内分泌紊乱、肾上

腺皮质功能及（3,17和21）羟化酶缺乏症等息息相关。各个类固

醇激素作为代谢网络中的节点相互影响，如能详尽表征代谢网络

上下游中各激素的含量变化情况，对临床疾病的确诊、机体内分

泌状态的监控等具有种重要意义。

临床传统方法采用放射免疫或ELISA试剂盒方法进行激素检

测，可能存在抗原抗体假阳性干扰，低浓度水平激素测定不准确

等问题。且临床对于不同激素检测方式不同，多激素全面检测所

需血液量较大，增加患者负担。液质联用法具有特异性强，检测

灵敏度高，适合高通量测定等优点，因此，建立一种基于液质法

的同时准确测定多种类固醇激素的分析方法，对于临床相关疾病

的诊断具有重要的指导意义。

本方法基于SCIEX 液相色谱串联质谱系统，采用同位素内标

校正法，建立了一次分析，同时准确检测血清中20种类固醇激素

的定量方法。20种类固醇激素相关信息如下。

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SCIEX液相色谱串联质谱法测定血清中20种类固醇激素

Determination of 20 Steroid Hormones in Human Serum Samples by

SCIEX Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

The Power of Precision

实验部分

样品前处理

本实验采用沉淀蛋白结合SPE固相萃取法对血清中20种激素

进行处理，具体步骤如下。

提取：准确量取200 μL样品于1.5 mL塑料离心管中，加入20 μL

同位素内标混合工作溶，200 μL甲醇，涡旋1 min，加入200 μL水，

涡旋1 min，10000 rpm离心5 min，取上层溶液待用。

净化：取SPE柱（Cleanert PEP 96 Well Microplates：2 mg），

依次用200 μL甲醇活化，200 μL水平衡。取提取后上清液350 μL，

加载至SPE柱，弃去滤液；依次用200 μL 10 %乙腈水溶液和200 μL

正己烷进行淋洗，弃去淋洗液；加入30 μL洗脱溶剂进行洗脱，收

集洗脱液，用10 %乙腈水溶液稀释至200 μL，混匀待测。

色谱条件

色谱柱：Kinetex® C18（2.6 μm，3.0×100 mm）；

流动相：A为0.5 mM氟化铵水溶液

B为甲醇，洗脱流程如表1；

流速：0.6 mL/min；

柱温：40 ℃；

进样体积：20 μL。

辅助气 (Gas2): 60 psi；

气帘气 (Gurtain Gas): 35 psi;

电喷雾电压：5500V (+) / -4500V (-)；

对应MRM通道及参数见表2，表3。

时间（min） A(%) B(%)

0 50 50

4 40 60

6.5 25 75

7.2 10 90

10 10 90

10.2 50 50

12 50 50

表1. 洗脱梯度

。

质谱条件

电离方式：电喷雾离子源，正负离子同时采集；

检测方式：分时间窗口 (schedule)，多反应监测 (MRM)；

离子源温度 (TEM): 600℃;

雾化气 (Gas1): 60 psi;

表2. 待测组分和内标物质的质谱参数（正离子模式）。

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The Power of Precision

结果与讨论

各化合物在各自出峰位置峰形对称，响应良好。在20种激素

中，17α羟孕酮和21羟基孕酮；11-脱氧皮质醇，21-脱氧皮质醇

和皮质酮为两组同分异构体，在本方法条件下，同分异构体间可

以实现基线分离。典型色谱图如图1。

结果与讨论

各化合物在各自出峰位置峰形对称，响应良好。在20 种激素中，17α 羟孕酮和21 羟

基孕酮；11-脱氧皮质醇，21-脱氧皮质醇和皮质酮为两组同分异构体，在本方法条件下，

同分异构体间可以实现基线分离。典型色谱图如图1。

图1 20 种激素典型色谱图

标准曲线

以PBS 为替代基质，制作标准工作曲线。各待测物典型标准曲线结果如下表。

负离子色谱图

正离子色谱图

标准曲线

以PBS为替代基质，制作标准工作曲线。各待测物典型标准

曲线结果如下表。

总结

本实验在SCIEX 液质连用平台上，搭建了一针进样，正负离子同时采集的Scheduled

MRM™ 方法，实现20 种激素的同步检测。实验采用SPE 法进行样本前处理，同位素内

标校准，对血清中20 种激素进行定量。方法线性良好，加标回收，精密度满足相关要求。

可用于临床实际样本的检测。