【飞诺美色谱】土鳖虫微粉中游离氨基酸分析报告

摘要：本实验采用目前广泛使用的以OPA(邻苯二甲醛)和FMOC(9-芴基甲基氯甲酸盐)为衍生剂的柱

前衍生HPLC氨基酸分析方法，同时采用反相高效液相色谱法，以正缬氨酸为内标物，使用 Durashell

AA 氨基酸分析方法包，分析土鳖虫微粉中游离氨基酸。本方法快速、灵敏、准确、无需要手工衍

生，可全自动化在线分析、衍生试剂无毒、无臭等优点。

关键词：高效液相色谱法；OPA(邻苯二甲醛)；FMOC(9-芴基甲基氯甲酸盐)；土鳖虫微粉；Durashell

AA；氨基酸

前言

氨基酸是生物体中重要的生命物质，是组成酶和蛋白质的基本单元。作为小分子，

氨基酸对生物大分子的活性及其生理功能起着极为重要的作用；作为配体，它可与多种

金属离子配位，为研究抗肿瘤、抗癌药物提供信息。各种氨基酸在生物体中具有不同的

生物功能，因此，准确灵敏地测定食物、药品和生物样品中氨基酸的含量具有十分重要

的意义。

本实验采用Durashell AA氨基酸分析方法包中的检测标准，使用Durashell AA氨基

酸分析专用柱对土鳖虫微粉中游离氨基酸进行测试。

实验部分

仪器、试剂与材料

试剂材料

流动相 A：称取十二水合磷酸氢二钠 7.2 g，十水合四硼酸钠 7.6 g，加水 2000 mL，

用盐酸（约 3.0 mL）调节 PH 至 8.2，用 0.45μm 滤膜过滤；

流动相 B：取甲醇 450 mL，乙腈 450 mL，水 100 mL，混匀，超声脱气；

稀盐酸：取 36%盐酸 4.16 mL，加水稀释至 500 mL；

衍生试剂（OPA）：取 Durashell AA 氨基酸分析方法包中 OPA-A 试剂 1 支，加入

OPA-B 试剂 60 µL，混匀，即得；

稀释剂：取 100 mL 流动相 A,加磷酸 0.5 mL，混匀；

混合氨基酸对照品：(L-门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-

精氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-脯氨酸、氯化铵、L-酪氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、

L-是色氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-赖氨酸浓度为 2.5 μmol/mL, L-

胱氨酸浓度为 1.25 μmol/mL)；

土鳖虫微粉：褐色粉末，由某药科大学提供。

样品制备

衍生用混合氨基酸标准溶液：准确量取氨基酸分析方法组件包中的氨基酸标准溶液

100 μL，置于 2 mL 样品瓶中，准确加入内标溶液 50 μL， 0.1 mol/L 盐酸溶液 400 μL，

混匀，作为衍生用混合氨基酸标准溶液；

衍生用土鳖虫微粉样品溶液：准确称取样品 0.5 g，加乙腈/水=50/50（v/v）25 mL，

混匀，超声处理 30 min，经 0.45 μm 针筒过滤器过滤，取续滤液作为样品试液，准确量

取样品溶液 500 μL，置于 2.0 mL 样品瓶中，准确加入内标溶液 50 μL，混匀，作为衍

生用样品溶液。

色谱条件

色谱柱：Durashell AA；3 μm；4.6 × 150 mm；

柱 温：45℃；

波 长：338 nm(22 min 切换波长为 262 nm)；

进样量：2 μL；

衍生程序：Durashell AA 氨基酸分析方法包中氨基酸衍生程序；

梯 度：

表 1.液相色谱梯度洗脱条件

结果与讨论

本实验采用 Durashell AA 氨基酸分析方法包对土鳖虫微粉中氨基酸进行了测试，

由图 2 可知，使用 Durashell AA 氨基酸分析方法包共检测出土鳖虫微粉中 17 种游离氨

基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好。

图 1. 19 种混合氨基酸对照溶液高效液相色谱图

按出峰顺序依次为：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨

酸、缬氨酸、蛋氨酸、正缬氨酸(内标)、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、铵离子、脯氨酸。

图 2. 土鳖虫微粉样品溶液高效液相色谱图

按出峰顺序依次为：门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨

酸、缬氨酸、正缬氨酸(内标)、色氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、铵离子、脯氨酸。

结论

根据实验结果，使用 Durashell AA 氨基酸分析方法包共检测出土鳖虫微粉样品中

17 种游离氨基酸，各氨基酸峰间的分离效果较好，能够满足检测要求。

附：相关产品