原子力显微镜力谱揭示抗生物黏附的分子机理

Bruker Nano Surfaces

2024/02/06 11:10

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胆固醇层熵斥力抵消生物粘附

Entropic repulsion of cholesterol-containing layers counteracts bioadhesion

布鲁克纳米表面仪器部岳俊培博士

内容简介

生物黏附性能对于生物功能性及仿生材料设计至关重要，而控制生物黏附背后的物理机理仍没有完全被理解。表界面纳米结构以及表界面组分（如蜡质、脂肪酸、胆固醇）对生物黏附都有至关重要的影响，而其中胆固醇的功能至今没有被揭示。来自于德累斯顿莱布尼兹聚合物研究所的Carsten Werner教授利用布鲁克Nanowizard原子力显微镜单分子/单细胞力谱、浸润性测试以及分子模拟等揭示了自由胆固醇定向分子结构波动引起的熵斥力限制了蛋白质、细菌在其表面的粘附，相关研究成果以“Entropic repulsion of cholesterol-containing layers counteracts bioadhesion”发表于Nature上，该工作为生物界面研究提供了一个新的物理化学视角，并可能指导未来调节生物粘附性的材料设计。

实验结果与讨论

作者对鞘翅目昆虫的疏水性抗生物粘附角质层进行了深入研究，一方面其表面悬垂横截面轮廓的纳米结构可防止湿润和细菌定植，另一方面富含脂质的包膜（包含胆固醇、脂肪酸和蜡酯）也被认为是防止生物黏附的一道防线。蜡酯是疏水物质，游离脂肪酸可杀死或抑制细菌和真菌的生长，而胆固醇的功能却没有深入理解。针对此问题，本研究利用旋涂法制备了脂质多层膜（SCLs），研究了溶菌酶、白蛋白、表皮葡萄球菌及大肠杆菌在其表面的吸附情况，结果显示在胆固醇的多层膜表面吸附远远低于对照组（图1f,g），且对于不同胆固醇含量的复合脂质多层膜研究表明胆固醇含量仅为1 wt%即可极大地减少蛋白的吸附，而含量达到10 wt%时即可达到纯胆固醇多层膜的效果(图1h,i)。胆固醇是双亲分子，作者利用巯基修饰，分别制备出极性官能团以及非极性官能团暴露于界面的脂质层（SAM），结果表明二者表面相对于胆固醇SCL层积累了更多的蛋白与细菌 (图1f,g)。这些结果表明胆固醇的界面流动性是抗黏附的关键。

图1. 鞘翅目昆虫表面结构与组成（a, b, c, d）; 随机取向(SCL)与定向（SAM）的自组装层；溶菌酶、白蛋白、表皮葡萄球菌及大肠杆菌在不同表面吸附（f,g,h,l）。

进一步地作者利用AFM胶体探针力谱、单细胞力谱仪对界面动力学进行研究。对疏水性胶体探针或单个大肠杆菌细胞与胆固醇 SCL 之间的相互作用力进行了量化，发现相互作用力随接触时间的延长而持续增加（图2），而硫代胆固醇和硫代胆酸 SAM 的对照实验表明相互作用力基本不变，说明胆固醇SCL界面极性发生变化。进一步的分析表明，三阶动力学控制着 SCL 界面的极性适应过程，使疏水相互作用最大化。

图2. 疏水探针（a）及单个大肠杆菌细胞修饰探针(b)与SCL及SAM层相互作用随时间变化图。

作者通过热力学测试以及分子模拟表明极性控制取向波动引起的熵斥力抑制了生物黏附，而通过原子力显微镜力谱获得了胆固醇SCL 界面取向波动的直接实验证据。疏水性AFM针尖与SCL层间的相互作用力范围涵盖了暴露极性与非极性表面相互作用力范围，证实了胆固醇 SCL 的界面上同时存在极性和非极性残基（图3）。在恒定位置重复进行力曲线测量显示，与胆固醇 SCL 的相互作用力变化大远高于硫代胆固醇 SAM，这证明了胆固醇在 SCL 界面的取向波动（图4）。

图3. 亲疏水探针与SCL、SAM层不同点相互作用力统计分布。

图4. 与SCL以及SAM单点多次测试获得相互作用力变化。

总结

本研究揭示了含有胆固醇的表面，如一些无脊椎动物的皮肤，可以排斥其他分子，阻止蛋白质和细菌的吸附。利用原子力显微镜力谱分析证实了胆固醇分子界面取向波动，而其产生的熵斥力是抗生物黏附的主要原因。胆固醇广泛存在于组织界面，该发现对生物研究中重要且无处不在的界面过程带来新的启示，并可能指导抗生物黏附材料的开发设计。