氮吹仪在动物组织DNA的制备提取及应用

一、实验原理

提取核酸的基本程序包括细胞破碎-解聚核蛋白并去除蛋白质-沉淀核酸并去除其它杂质三步。破碎细胞的方法很多，高等动植物材料常用液氮研磨法。

核蛋白利用DNA核蛋白在0.14mol/L Nacl盐溶液的溶解度很低的特点而实验其与RNA核蛋白分离，残存的RNA经 R Nase水解而去除。

蛋白质经蛋白酶水解，并经苯酚、Trichloromethane变性而分开。提纯过程中的DNA酶活性经低温操作并用SDS解聚或柠檬酸三钠和EDTA^.Na2等螯合剂抑制。逐渐纯化的DNA经乙醇或异丙醇沉淀而收集，最终实现DNA分离纯化之目的。

二、实验用品

  （一）器材

（1）离心机。

（2）水浴锅。

（3）紫外分光光度计。

（4）研钵、液氮、带盖离心管。

（二）试剂  

（1）蛋白酶K:用水或TEN9溶液溶解成10mg/ml，或直接用粉末。

（2）TEN9 pH9.0:称取Tris6.05g EDTA^.Na₂37.224g和NaCL 11.688g按顺序溶于蒸馏水中，以HCL调PH9.0。

（3）TE溶液：50mmol/L Tris.HCL(PH8.0)-10mmol/L EDTA^.Na₂(PH8.0)。

（4）SS-phenol:以Tris平衡重蒸酚至PH8.0，加入0.1%的8-羟基喹啉（使溶液呈黄色，防止酚的氧化）。

（5）1mmol/L Tris.HCL(PH8.0)：Tris121.14g溶解于蒸馏水中，以HCL调PH至8.0定容至1L。

（6）20% SDS:20g SDS溶于100ml蒸馏水中，配制时要小心，SDS对呼吸道有强烈的刺激，且毒性较大。

（7）RNase A 若试剂含有痕量DNase，用前100℃ 10min灭活DNase。

（8）3mol/L NaAc,pH6.5:称取NaAc^.3H₂O408.1g溶于蒸馏水中，HAc调PH至6.5后定容至1L。

   TEN9、 Tris.HCL、NaAc均需高压灭菌。

（三）材料

    新鲜兔肝或鸡肝。

二、实验程序

（一）操作方法

 1.操作步聚

 （1）在液氮存在的条件下，于研中将5g动物组织碾成细粉（约需20~30min）。

 （2）待液氮挥发后，将细粉转至50ml带盖的离心管中，加入20mlTEN9和RNase(100µg/ml),混合均匀，加入1ml 20%SDS，将离心管上下颠倒几次，并继续轻揺10min。

（3）加入10mg蛋白酶K粉末，慢速搅拌使之溶解并混匀。

（4）在37℃至55 ℃保温2~4小时，其间不时地轻摇。

（5）如需要，再加入10mg蛋白酶K粉末，继续保温至少2h，使组织充分消解。

（6）加入20ml SS-phenol,温和颠倒离心管，使两相充分混合，形成类似乳浊液状。

（7）室温，10000r/min离心10min，使混合液清晰分相（如分层不明显，可适当加大离心力及离心时间）。上层水相含DNA，中间为变性蛋白质，下层为酚相。

（8）用大口吸管将上层水相转至另一只离心管中，弃去界面相和酚相。

（9）将第6~8步重复进行几次，直至中间相完全消失（蛋白质必须去除干净，否则对DNA的溶解及酚切都不利）。

(10)离心后，将水相转到透析袋中以去除小分子物质。在TE中透析（稀释因数应大于1000，稀释因数指外界溶解与待透析液体积比的累积乘积），并用磁力搅拌器搅拌，提高透析效率，2h后转至4℃继续透析4h或过液（开始时，溶液中含大量的SDS，低温下易析出，因此开始时必须先在温室透析，由于透析袋较昂贵，用后可用TE浸泡，煮沸10min,可续用），可静止透析。

（11）将透析后的溶液转至50ml离心管中，加入NaAc溶液，使其终浓度为0.3mol/L,再加入0.8体积的异丙醇，温和混匀（亦可用2倍体积的乙醇代替异丙醇，但可能使沉淀体积过大）。

（12）用玻璃棒绕起或钩出呈现纤维状的DNA，由于异丙醇不易干燥，可用70%的乙醇快速冲洗干燥后，在2~5ml TE中完全溶解，并置冰箱保存。

（13）测定此DNA溶液在260nm和280nm波长下的OD值，此值应大于1.7.如果小于1.7，则说明含较多的蛋白，需加少量蛋白酶K保温后，用SS-酚进一步抽提。另外，235nm处为盐类及小分子化合物的吸收峰，因此应大于1.7。

2得率的计算

由于1OD₂₆₀的DNA浓度为50µg/ml，因此DNA得率可按下公式计算：

1g新鲜组织的DNA含量=OD₂₆₀×50×溶解体积/组织鲜重（µg DNA/g）。