如何从哺乳动物的血液中提取红细胞膜

实验原理

生物膜的研究发展迅速，要研究生物膜的组成、结构及功能，首先必须分离出纯净的细胞膜。

分离状态下的哺乳动物的红细胞膜，一般称为“血影”。哺乳动物的红细胞中没有通常真核生物细胞内所含有的任何细胞器，容易制备得到纯粹的细胞膜，取材方面来源也十分方便，是研究细胞膜的好材料。

从哺乳动物红细胞中分离细胞质膜，第一步是收集血液并置于加有抗凝剂的容器内，用低速离心的方法从血液中分离得红细胞，然后用等渗缓冲液重复洗涤多次，去除血浆。第二步，将洗净的红细胞从等渗缓冲液转移到低渗缓冲液中，由于渗透压力作用于细胞质膜，使红细胞膨胀而溶血。最后一步，将溶血的红细胞经过充分反复洗涤，高速离心，去除血红蛋白和其他细胞内含物。这样制备所获得的最终产品几乎全是红细胞膜。

二、实验用品

  （一）器材

（1）冰冻离心机。

（2）相差显微镜。

（二）试剂  

（1）pH7.4的等渗磷酸酸盐缓冲液

  贮液A：称取0.780g磷酸二氢钠溶于水，定容至1000ml。

  贮液B：称取3.582g磷酸氢二钠溶于水，定容于2000ml。

取380ml贮液A加1620ml贮液B，用少量浓HCL调PH至7.4，再称17.53gNACL溶于其中。

（2）PH7.4低渗Tris.HCL缓冲液：

      贮液A：称取2.42gTris，溶于水，稀释至500ml。

      贮液B：取0.84ml36%-38%HCL,稀释至500ml。

   取500ml贮液A加414ml贮液B，用水稀释至近于2000ml，用6mol/L HCL调PH室7.4，再定容至2000ml。

    （3）肝素-PH7.4等渗磷酸盐缓冲液：将肝素溶在PH7.4等渗磷酸盐酸缓冲液中，每ml含肝素500单位。

（三）材料

         哺乳动物的血液。

三、实验程序

   （一）操作方法

      1.血液收集及红细胞的洗涤

       将血液收集在含有抗凝剂的容器中，每30ml血液加约5ml肝素-PH７.４等渗磷酸盐缓冲液。为避免膜上含有的或膜上吸附的蛋白酶使膜蛋白发生变化，以下操作应在０－４℃下进行。取３０ｍｌ血液，于冰冻离心机中，４℃ ，3000r／min离心20min，使红细胞沉淀。用吸管吸血浆及沉淀的红细胞表层的绒毛状沉淀层。这对于避免其他类型细胞的混入十分重要。

将红细胞置于3倍量预冷的PH7.4等渗磷酸盐缓冲液中，用玻璃棒缓慢地搅拌悬浮，于4℃，5000r/min 离心15min,除去上清液及沉淀表层，重复洗涤3次。

2.溶血及红细胞膜的洗涤

在洗净的红细胞中，按照1：40的比例加入预冷的PH7.4低渗Tris.HCL缓冲液，边加边缓慢地搅拌，置于4℃冰箱中1-2h，使之完成容血。然后于4℃，9000r/min离心20min,使红细胞膜沉淀。重复洗涤、离心3~5次，最后获得白色的红细胞膜样品。

3.细胞膜的镜检

  取少量膜样品悬液，在相差显微镜下进行观察，确定膜制品是否纯净。在视野中应不含有完整的红细胞或污染的细菌。

4.膜蛋白含量的测定

  取0.2ml膜样品悬液，用水稀释到1.0ml,制得膜样品稀释液。取0.1，0.2和0.5ml样品的稀释液用Folin酚试剂法测定膜样品中蛋白含量。

 5.膜的冰冻干燥

剩余的膜样品放在一个称好重量的小称量瓶中，冰冻干燥至样品全干，称量带有冰冻干燥制品的小称量瓶，记录膜的产量 。将冰冻干燥的膜制品，置于干燥器中冰冻保存，以备膜结构成分的分析。