广东岭南师范大学周国华课题组实现高灵敏度的蛋白质检测，Microchemical Journal | 用户成果速递

核酸酶已成为利用核酸检测各种靶标的有效工具。可以利用核酸酶的催化特性来放大响应信号，从而实现高灵敏度的检测。核酸外切酶III (Exo III) 专门催化从双链 DNA 的平端或凹陷3'-羟基末端顺序去除单核苷酸。因此，Exo III 被设计为促进目标分子的“循环利用”，从而实现信号放大和核酸目标的灵敏检测。

某些蛋白质标志物的灵敏检测对于疾病和癌症的早期诊断、治疗和预后具有重要意义。在生命科学研究中，定量测定蛋白质的水平（尤其是痕量表达的蛋白质）对于理解复杂的生命过程非常重要。目前，异质酶联免疫吸附测定（ELISA）和生化测试主要用于蛋白质检测。不幸的是，这些方法除了特别耗时之外，还需要使用昂贵的实验室设备和训练有素的人员。而且生物样品中蛋白质的丰度较低，往往超出高科技仪器的检测限，并伴有高浓度的共存干扰物。所以，将 Exo III 介导的信号放大纳入通用蛋白质检测中，提供一种高灵敏度且省时的方法，将对生命科学研究以及疾病的诊断、治疗和预后产生重大影响。

岭南师范大学周国华团队将 Exo III 辅助信号放大与结合诱导的 DNA 组装相结合，以实现高灵敏度的蛋白质检测。两条独立的单链 DNA 在与同一靶标结合后会杂交，并触发 Exo III 辅助的靶标循环扩增。该策略可以实现所有蛋白质的均质检测，并讨论了检测条件和性能。以人附睾蛋白 4（HE4）为例，线性检测范围为0.01~50 ng/mL，LOD 为3 pg/mL，可实现快速检测。值得注意的是，长时间孵育可以获得0.05~1 pg/mL 范围内的线性关系。该方法将对生命科学研究、疾病诊断、治疗和预后产生积极影响。

高灵敏度的蛋白质检测方法示意图

通过设计含目标蛋白与无目标蛋白的对照组，接着对对照组进行荧光强度的测定，通过对含目标蛋白与无目标蛋白的荧光强度差的分析，从而判定本方法的可行性。研究使用 HORIBA FluoroMax-4 荧光光谱仪检测生物素与链霉亲和素（SA）结合后 MB（文中一段 DNA 序列） 的荧光变化。由于 FAM（一种荧光素） 和淬灭剂之间存在较强的荧光共振能量转移（FRET），MB 的荧光最初较低。探针和 Exo III 的加入只会带来微不足道的荧光变化。但是，SA 的存在会导致荧光显著增加，从而证实了该检测策略的有效性。此外，与没有 Exo III 的情况相比，荧光增强了 324%，这证实了 Exo III 促进了循环信号放大。

使用 HORIBA FluoroMax-4 荧光光谱仪表征荧光强度

此外，研究还使用 DNA 组装策略实现对不同浓度 HE4 的检测，从而判断检测方法的泛用性以及灵敏度。在 37°C 和 4°C 条件下，使用 FluoroMax-4 得到线性响应范围分别为 0.01 ~ 50 ng/mL 和 0.05 ~ 1 pg/mL。与大多数报道的蛋白均相分析相比，该方法表现出更高的灵敏度。

a）蛋白质的均相免疫检测示意图；

b) 和 c) 分别是在 37◦C 和 4◦C 下荧光信号与 HE4 浓度的线性关系曲线

"FluoroMax-4 荧光光谱仪的高灵敏度高、稳定性好，对我们的研究很有帮助。"研究人员表示。

"通过修饰特异性抗体，这种改进的技术如预期的那样扩展了 Exo III 辅助扩增方法对所有蛋白质的高灵敏度检测。我们相信，它将在生命科学研究和疾病诊断中对蛋白质的检测运用广泛。"研究人员表示。

引用文章

Zhou G ,Luo C ,Huang J , et al. Binding-induced DNA assembly makes Exo III-aided signal amplification universal for highly sensitive protein detection[J]. Microchemical Journal, 2024, 200110371.

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周国华：ghzhou@lingnan.edu.cn

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