吡咯里西啶生物碱：使用精确质量数 Q-TOF LC/MS 和全离子 MS/MS 表征植物性药物和膳食补充剂

摘要

吡咯里西啶生物碱(PA) 及其N-氧化物(PANO) 对于人类和动物均有严重的肝毒性作用，需要一种稳定的分析方法对它们进行检测、表征和定量分析。尽管三重四极杆液质联用系统非常适合用于靶向检测，但是靶向分析需要的标准品不一定能够轻松获得。仅有一部分天然存在的已知PA 具有标准品。三重四极杆分析也不适用于筛查未知物。可提供精确质量数据的高分辨率质谱仪能够表征未知的PA/PANO，且不需要特定的标准品。

本应用简报介绍的工作流程使用精确质量数Q-TOF LC/MS 与全离子MS/MS 和数据库/质谱库搜索相结合，对植物性药物和膳食补充剂中的PA 和PANO 进行灵敏的选择性表征、筛查、初步鉴定和定量分析。使用高分辨率精确质量数MS/MS 谱图对25 种PA/PANO 标准品进行了表征。利用这些数据创建个人化合物数据库与谱库(PCDL)，然后利用PCDL 筛查44 个植物性药物和膳食补充剂样品中的PA/PANO。使用Q-TOF LC/MS 响应进行定量分析。使用特征碎片离子和碎裂图谱初步鉴定了非特异性靶向的PA/PANO。表征的PA/PANO 可能有助于在其他植物性药物和膳食补充剂样品中发现更多独特的PA。

前言

吡咯里西啶生物碱(PA) 是植物因防御昆虫取食所产生的天然次级代谢物。它们通常存在于紫草科（勿忘草和聚合草）、菊科（向日葵）和豆科（豌豆）植物中。PA 及其N-氧化物(PANO) 以杂环有机化合物吡咯里西啶为基础形成中心化学结构。

由于PA/PANO 对于人类和动物均存在肝毒性作用，因此它们的检测、表征和定量分析受到了高度关注。在鉴定出的350 多种PA 中，约一半的化合物有毒。毒性作用主要表现在静脉闭塞症(VOD)，这是一种因肝脏小静脉阻塞而造成的疾病。从饮食中去除PA 后，这些毒性作用中的多数是可逆的，但如果发生肝硬化，则成为了不可逆作用。低浓度长期暴露可能致癌。德国委员会 E 建议草药中PA 或其PANO 的限制摄入量为1.0 μg/天（最长6 周）或0.1 μg/天（无时间限制）。

PA/PANO 通常聚集在植物的种子或开花部分中，并且可通过牛奶、内脏、鸡蛋和肉类产品转移到人体内。千里光是PA 的一种来源，动物吃草时会将其摄入。红花琉璃草并不是牲畜喜爱的牧草；而在混入颗粒草料或储存草料后则会被牲畜食用。以植物为食的昆虫体内也可积累PA，从而会使蜂蜜中含有PA。需要关注的另一个问题是因食用含PA 的草药引起的健康风险，如琉璃苣叶、聚合草（用作花草茶）、线叶千里光和款冬。具体案例之前已有报道。

PA/PANO 的毒性和暴露的可能性会造成严重的健康威胁，因此需要改进其检测方法。尽管天然存在的PA 的结构

多样性为痕量分析和定量分析提出了挑战，但已有多种分析方法的相关报道。经典方法包括比色筛检、薄层色谱(TLC)、核磁共振(NMR)、气相色谱(GC)、液相色谱(LC) 和液质联用法(LC/MS)。利用GC 分析PANO 时需要进行衍生化处理。LC 需要的样品前处理步骤较少，并能同时测量PA 和PANO。采用电喷雾电离(ESI) 的LC/MS为首选方法，因为PA（特别是PANO）具有极性。三重四极杆液质联用仪用于靶向检测。这是一种严格的化合物鉴定和定量分析方法。然而，靶向分析需要的标准品可能不容易获得。仅有一部分天然存在的已知PA 具有市售标准品。因此，虽然基于三重四极杆的分析非常适合进行靶向定量分析，但其不适用于筛查未知物。在缺少特定的标准品时，可提供精确质量数据的高分辨率质谱仪是一种检测和表征未知PA 及其衍生物的解决方案。母离子和碎片离子的精确质量数可用于鉴定（但并非确证），也可在使用谱图数据库搜索精确质量谱图时快速筛查大量化合物。全扫描质谱图支持对未包含于数据库中的化合物进行鉴定并对数据进行回顾性分析。本应用简报介绍的工作流程使用精确质量数Q-TOF LC/MS 与全离子MS/MS 数据采集和处理以及质谱库数据库搜索相结合，对植物性药物和膳食补充剂中的PA 和PANO 进行灵敏的选择性表征、筛查、初步鉴定和定量分析。使用高分辨率精确质量数MS/MS 谱图对25 种PA/PANO 标准品进行了表征。利用这些数据创建个人化合物数据库与谱库(PCDL)，然后利用PCDL 筛查44 个实际植物性药物和膳食补充剂样品中的PA/PANO。使用Q-TOF LC/MS 响应进行定量分析。使用特征碎片离子和碎裂图谱初步鉴定了非特异性靶向的PA/PANO。表征的PA/PANO 有助于在其他植物性药物和膳食补充剂样品中发现更多独特的PA/PANO。补充性研究“Characterization and screening of pyrrolizidine alkaloids and N-oxides from botanicals and dietary supplements using UHPLC-high resolution mass spectrometry”（使用UHPLC-高分辨率质谱表征和筛查植物性药物和膳食补充剂中的吡咯里西啶生物碱及其N-氧化物）中详细介绍了分析方法和结果。

结论

已知对人类和动物存在肝毒性作用的PA 和PANO 通常存在于许多植物（包括紫草科、菊科和豆科植物）中。需要关注的另一个问题是因食用含PA/PANO 的草药和补充剂引起的健康风险。因此，PA/PANO 的检测、表征和定量分析均非常重要。

尽管三重四极杆液质联用系统非常适合用于靶向检测，但是靶向分析需要的标准品不一定能够轻松获得。此外，三重四极杆分析不适用于筛查未知物。具有全离子 MS/MS 功能的Agilent 6530 精确质量数Q-TOF 液质联用系统为筛查PA/PANO 指示性碎片的存在情况提供了一种解决方案，方案中无需使用特定的参比标样。使用高分辨率精确质量数MS/MS 谱图对25 种PA/PANO 参比标样进行了表征。利用这些数据创建PCDL，该PCDL 能够帮助作者筛查植物性药物和膳食补充剂样品中的 PA/PANO 型化合物。使用特征碎片离子和碎裂图谱初步鉴定了非特异性靶向的PA。结果表明，该方法是一种高度灵敏、高选择性且高效的方法，能够通过一次色谱运行对植物性药物和膳食补充剂中的已知及未知 PA/PANO 进行表征。表征的PA 可能有助于在其他样品中发现更多独特的PA。