【安捷伦】跨越一维液相待解难题，让生物制药研发开启“加速快车道”

背景

如今生物制药（单克隆抗体和其他治疗性蛋白）大约占整个医药市场的 20％ ,预计在目前的十年内新增的批准药物中 50％ 以上将是生物制药，其中单克隆抗体占主导地位。在这类药物的研发和整个产品生命周期过程中，都伴随着深入的质量表征的需要。不同于小分子药物，蛋白质生物制药分子量大，异质性强，解析它们的质量属性充满挑战。

mAb 药物的常见分析流程有 top-down, middle-up, bottom up 三种。对于以上这三种流程，一维的方法普通存在的局限性主要有两点：

• SEC，IEX，HIC 等分离模式流动相质谱不兼容，无法直接进入质谱得到精确分子量信息；

• 相对于生物药物结构的复杂度，一维色谱分离能力有限（ HIC，SEC，IEX，RP ）。

多维色谱技术的出现让这些一维技术应用中不可逾越的难题，变得轻而易举，让生物制药的研发流程进入“加速快车道”。

生物制药中常用的分析检测手段包含离子交换 IEC 用来分析电荷异质性、疏水层析 HIC 分析异构和氧化异质性、分子筛 SEC 分析聚集体和碎片等，但是 IEC、HIC、SEC 的液相方法都是高盐体系，流动相往往是质谱不兼容的，这时如果想要通过质谱进一步研究其中的不同峰到底是什么样的异质性，往往需要手工收集、除盐、浓缩等繁琐的步骤。而通过 2DLC 可以把这些高盐体系的洗脱峰直接切入到第二维，进行在线除盐，在不改变一维分离状态的前提下，直接在线对洗脱的峰质谱定性，从而能够高效准确的完成蛋白药物的质量属性分析。

除盐实例 1：离子交换-在线胰酶酶切-MS 肽图水平分析电荷异质性

IEC 分析电荷异质性，通常 mAb 分子量大约 150Kd，如果直接完整蛋白除盐进入高分辨质谱，往往只能看到质量数变化比较大的异质性，但是对于质量数变化很小的变异（比如脱氨，分子量变化只有 1Da ），完整蛋白水平很难准确分析判断。

基于安捷伦二维液相扩展的四维系统，可以对离子交换电荷异质体进行在线酶切肽图分析，能够清晰的看到脱氨基、氧化等 PTM 带来的电荷酸碱变异。

4D HPLC/MS 在线除盐酶切系统：一维 IEC 分离 mAb 电荷异质体；二维反相捕获、还原；三维在线胰酶酶切；四维 Peptide Mapping 进入 MS 分析

参考文献

Gstottner, C.; Klemm, D.; Haberger, M.; Bathke, A.; Wegele, H.;Bell, C.; Kopf, R. Anal. Chem. 2018, 90 (3), 2119?2125. (IF 6.042)

除盐实例 2：HIC在线除盐对单抗氧化异质性的质谱定性分析

前后两个峰分子量相差 64Da，由此分子量差异推测此蛋白药物上可能有 4 个位点发生了氧化导致氧化峰出现。

通过 2DLC 可以把 Protein A 亲和层析和 SEC\IEC\RP 等检测项目串联起来，取细胞上清后进样，第一维通过 Protein A 测得蛋白实时表达量，同时经过 Protein A 也完成了在线净化、除去宿主细胞中其他成分，第二维如果接 SEC 可以分析聚集体含量，如果接 IEC 可以分析电荷异质性，接反相可以在线除盐质谱检测分子量。通过 Protein A-SEC\IEC\MS 的方式可以一针进样得到表达量和其他关键质量属性，相对于传统流程会省去了一步 Protein A 离线前处理，提高实验室分析效率。

高通量自动化实例一： Protein A – SEC 

高通量自动化实例二：Protein A -IEC

高通量自动化实例三： Protein A - MS

参考文献

Sandra, K.; Steenbeke, M.; Vandenheede, I.; Vanhoenacker, G.;Sandra, P. J. Chromatogr. A 2017, 1523, 283?292. (IF 3.716)

Williams, A.; Read, E. K.; Agarabi, C. D.; Lute, S.; Brorson, K.A. J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2017, 1046, 122?130. 

Peptide Mapping 的色谱图往往有共流出现象，很难把氨基酸突变或者翻译后修饰的峰全部分离出来。通过二维液相可以把 SCX/HILIC/RPLC 和 RPLC 分离能力结合，大大提高 Peptide Mapping 色谱方法的峰容量，通过二维的紫外谱图和质谱图可以看到更精准的质量信息。

参考文献

Vanhoenacker G1, Vandenheede I, David F, Sandra P, Sandra K. Anal Bioanal Chem. 2015,407(1): 355-66. (IF 3.307)

超过 90% 的蛋白质药物包含糖基化修饰。这些寡糖链的存在、缺乏、连接位点和相对丰度特征对于药品的效力、药代动力学、免疫原性、折叠和稳定性具有显著影响。Hilic 模式是分析亚基糖基化的有效分离模式，往往需要加入 TFA 获得良好峰型，但是即便加入 TFA，也很难把 Fc/ 2 和 Fd 完全分离，通过第二维 RP 反相甲酸分离，使得各个亚基和亚基上的糖型充分分离，并且第二维采用甲酸体系可以进入质谱，直接完成亚基水平的糖型表征。

参考文献

Stoll, D. R.; Harmes, D. C.; Staples, G. O.; Potter, O. G.; Dammann,C. T.; Guillarme, D.; Beck, A. Anal. Chem. 2018, 90 (9), 5923?5929. (IF 6.042)

访问 www.agilent.com/chem/2d-lc，了解安捷伦二维液相产品信息。

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