利用紫外引导的开放操作纯化策略对天然产物提取物进行制备

Andrew Aubin、Ronan Cleary and Darcy Shave
Waters Corporation, Milford, MA, U.S.
应用效益
本应用文献介绍了通过开放操作型纯化系统来帮助化学师简化原料提取物纯化方法选择的技术。与一种用于各种提取物的通用方法相反，简单的方法选择标准（基于薄层色谱分析）使分离方法可根据具体的提取物量身打造。这使化学师可减少进行再分析和再纯化步骤的次数；最终加快整个纯化过程的速度。
沃特世的解决方案
基于组件的制备型HPLC模块
MassLynx™软件
FractionLynx™和开放操作型应用管理程序
基于OBD™技术的SunFire™ C18制备柱
关键词
五味子、肉桂、野葛、开放操作、制备型色谱、FractionLynx应用管理程序
引言
从植物材料中提取药用活性化合物可通过多种不同的方法得以实现。最终，化学师得到一种包含可能活性化合物并混有其他非活性成分的原料提取物。提取后，下一个步骤是对那些目标化合物进行纯化或分离。制备型液相色谱多用于完成这项任务。可能被提取的化合物具有较大的差异性，这样进行一次充分纯化需要使用不同的色谱方法才能达到有效分离。因此，能为化学师提供多种方法的开放操作型液相色谱系统是值得拥有的。分析方法在柱大小、运行时间、梯度条件、溶剂、改性剂和其他变量方面可有所改变。这些选项使化学师难于选出适用于其提取物的最佳方法并会拖延目标化合物的分离和开发进程。
为帮助每位化学师简化对其提取物选择适当首试方法的过程，本文介绍了一台使用简单方法选择标准（基于薄层色谱分析）的开放操作系统。
通过使用为其提取物量身打造的分离方法，化学师能更好地获得纯度更高的化合物。与对所有提取物使用一种通用方法相反，化学师通过选择适当的方法，可从根本上减少进行再分析和再纯化步骤的次数，进而最终加快了整个过程的速度。
实验
样品和提取
本试验对三种不同的植物材料进行了提取： 五味子粉（Schisandra Chinenis）、肉桂片（CinnamomumZeylanicum）和野葛根粉末（Pueraria lobata）。将10克干样品加入至50 mL、体积比为60:40的甲醇/水混合液后，振荡1小时。对提取物进行离心；之后直接使用离心后的清澈提取液。未尝试对提取过程进行优化。
薄层色谱（TLC）
提取物使用正己烷和乙酸乙酯的混合液在5 x 20 cm的TLC硅胶板上（Partisil LK6F硅胶60A及荧光指示剂，英国梅德斯通市沃特曼公司）进行分离。通过将层析板暴露于紫外光下并观察斑点而实现了样品的可视化。比移值从这些观察结果中得出。
制备型液相色谱
制备型HPLC分析使用一台由沃特世2545型四元梯度模块、2489型紫外/可见光检测器、制备型色谱架以及基于SunFire Prep C18 OBD柱（5 μm、19 x 100 mm）的馏份收集器III组成的系统。整台系统使用同时配备FractionLynx和
 
开放操作型应用管理程序的MassLynx软件进行控制。表1概述了方法参数、流动相组分和梯度条件，如第3页所示。
结果和讨论
为简化决定“我应使用哪种分离方法”的过程，用户必须先收集一些样品信息。理想状态下，将先进行一系列分析级HPLC分离，然后制备型方法根据这些结果导出、形成并按比例扩大。在很多情况下，这种复杂过程非常耗时，而且不必要。当在研究最初阶段一次性处理多种提取物时，这一点尤其正确。现有一种更简单的方法可进行基于薄层色谱的初期评估、评价所得出的结果并根据目标化合物的比移计算值设计出一种适当的制备型液相色谱方法。在本例中，提取物先通过薄层色谱进行分析，如图1所示。用户根据薄层色谱的分析结果可设计出一种具有特异性分离特征的方法或者使用已在HPLC系统中设计好的方法，如图2所示。







为进一步精简HPLC纯化过程，仅使用开放操作系统的登录页面即可简化方法的选择，如图2所示。勾选登录按钮后，用户可通过手动进样器简单实现进样。检测运行完成后，结果可被打印出来或电邮发送给用户。这些梯度旨在确保即使用户选择了一种欠佳的方法，所有潜在的目标化合物也能从柱上被洗脱下来并得到收集。关于这一点的一个示例可参见图3，该色谱图
显示了使用梯度2分离出的肉桂提取物。两种洗脱时间非常晚的化合物在薄层色谱目标化合物之后较长时间才得到收集。

 
图4和图5显示了使用所述技术分离出的野葛根提取物和五味子提取物。这三种天然产品提取物的色谱图与薄层色谱板得出的结果类似，表明此项技术提供了一种适合的工作流程。一旦分析完成，样品结果可根据需要电邮发送给用户或打印出来。系统管理员可决定登录准入权限、方法选择和报告生成，进而完成系统配置和设置。系统管理员也可增加或减少用于分析选择的可用方法个数。2545型四元梯度模块可同时选择四种溶剂，这提供了选择多种缓冲液或替代型有机改性剂的可能性。制备型色谱架可便捷容纳多根色谱柱和一对进样器，从而增加了方法选择的灵活性。

 

作为系统功能的最终确认，收集自野葛根提取物的馏份使用一台分析型HPLC系统进行了再分析，如图6所示。结果显示分离和收集到野葛根的纯净单峰，这可用于后续的研发步骤。

 
结论
■ 沃特世的开放操作系统使化学师能仅通过走到液相色谱系统旁、登录样品信息、进样、离开几个步骤就能对其制备前的样品进行分析。
■ 方法参数可自定义，从而能满足个体实验室工作流程的要求。
■ 由于可为一位化学师呈现所需的多种方法，因此能对潜在活性化合物的收集实现最优化。
■ 通过使用为其化合物量身打造的方法，化学师能用可能最短的时间从混合物中获得更高质量的馏份，从而加快了研究过程的速度。
 
关于沃特世公司 (www.waters.com)
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