ACQUITY UPLC-TUV测定奶粉和牛奶中三种牛乳清蛋白的含量

摘要
一种α-牛乳清蛋白和两种β-牛乳清蛋白标准分别用超纯水稀释配制，采用ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱分离，ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色谱检测。Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种乳清蛋白可达基线分离，线性范围为1.000-100.000mg/kg，复相关系数R2≥0.999，方法的检出限为1.000 mg/kg。
关键词：超高效液相色谱 奶粉 牛奶 牛乳清蛋白 Bα-La Bβb-Lg Bβa-Lg

前言
乳清蛋白是牛奶中的主要蛋白质，乳清蛋白主要包括α-牛乳白蛋白(Bα-Lactalbumin，Bα-La)、β-牛乳球蛋白(Bβ-Lactoglbulin，Bβ-Lg)、蛋白酶-胨和牛血清白蛋白等，前两者是乳清蛋白的主要成分，分别占其总量的10-20%和40-50%，β-牛乳球蛋白包括Bβb-Lg和Bβa-Lg两个遗传变异体[1-2]。

乳清蛋白具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，已经被越来越多地应用于食品工业，市场上同时出现了不同种类和品牌的乳清蛋白保健品，如儿童营养蛋白粉、婴儿配方奶粉等[3]。但有报道乳清蛋白又是一种常见的过敏原，β-乳球蛋白是最主要的过敏原，α-乳白蛋白紧随其后[4]。UPLC以其1.7μm超细填料色谱柱和15000psi的超高效液相色谱系统，可以完美实现Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种乳清蛋白分离；尤其对于Bβb-Lg和Bβa-Lg两个遗传变异体可实现完全分离。以及配备高灵敏度Waters ACQUITY TUV紫外检测器，整个系统检测三种乳清蛋白检出限达到1ppm。该检测方法可应用于牛奶或奶粉中α-牛乳白蛋白和β-牛乳球蛋白的定量检测。

实验方法
材料、试剂和仪器
乙腈为色谱纯，三氟乙酸为优级纯，Triton X-100，氯化钠（优级纯），实验用水为超纯水(18MΩ,TOC 3ppb)，牛乳清蛋白标准品Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg；ACQUITY UPLC®超高效液相色谱系统，配Acquity TUV检测器、FILTER MIXER (425μl,P/N 205000403）。

色谱条件
液相系统： Waters ACQUITY UPLC®
           配ACQUITY TUV紫外检测器
色谱柱：  ACQUITY UPLC BEH300 C18
          2.1mm x 100mm，1.7 μm
柱温：    35˚C
流动相：   A：0.1%TFA乙腈溶液
          B：0.2%TFA水溶液;梯度洗脱
检测波长： 280nm
分析时间： 15 min
进样量：  10μl(样品进样2ul)
梯度方法见下表：
时间/(min)     流量/(ml/min)         A%             B%             曲线
0              0.20                  39             61             初始
3              0.20                  41             59                6
4              0.20                  44             56                6
8              0.20                  46             54                6
10             0.20                  70             30                1
15             0.2                   39              61               1

数据处理系统
Empower 2 中文版

前处理方法
称取0.20 g奶粉样品或2ml液态奶样品，添加8mL(对于液态奶添加6ml)0.3M 的氯化钠(含0.2%的Triton X-100)溶液溶解，震荡混匀；然后用0.3%的TFA水溶液调节pH至4.4-4.6之间(以沉淀酪蛋白，其等电点为4.6，需要认真控制pH，因为乳清蛋白的等电点为4.8），定容至10 mL，均质5分钟，室温静置1个小时左后，2500转离心10分钟，取上清液过0.2um滤膜

结果与讨论
标准配制
三种乳清蛋白标准均用超纯水稀释，配制成不同浓度的标样进行检测，可得到较好色谱峰形，并且配制简单。

检测波长的选择
应用Waters PDA检测器扫描得到三种乳清蛋白的紫外吸收光谱图，如图1至3所示。

乳清蛋白在220nm和280nm下都有紫外吸收，本文选择两种波长对三种乳清蛋白(浓度均为5ppm)进行检测，结果发现虽然分析物在220nm下具有最大的紫外吸收，同时在该波长下其也具有较高的基线噪音和干扰，因此本文选择280nm作为检测波长，减少流动相中的基线干扰，如图4所示5ppm的标准色谱图。

流速、流动相优化
如图4三种牛乳清蛋白混合标准的色谱图，按照保留时间依次是Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg，对于高分子量的蛋白分析，采用Waters孔径为300À的ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱进行分离，此外,考虑到大分子蛋白的传质特性，需要使用较小的流速，方能实现较好的分离。本文试验了0.1ml/min、0.2ml/min和0.3ml/min三种流速，0.1ml/min死时间达到2.5min，整体出峰时间较晚，峰宽加大，最终综合峰形、快速和分离度考虑选择0.2ml/min流速，如图4所示。
在当前的分析条件下Bα-La具有较好的保留，然后改变流动相配比，得到标准品的四种配比色谱图(如图5)，由图可以看出，1号色谱峰图中Bβb-Lg和Bβa-Lg两种遗传变异体达到完美的分离(分离度=2.79)；随着梯度的变化，在保持Bα-La保留时间不变的情况下，逐渐加快Bβb-Lg和Bβa-Lg的出峰时间，两种化合物的分离度逐渐变化为1.97(4号色谱图)，灵敏度也稍有增加。但是考虑在分析实际样品时，减少可能存在的杂质对分析物的干扰，本文采用1号色谱图梯度方法进行检测。

实际样品检测发现，样品的Bα-La前面有较多的杂质峰存在，因此为防止实际样品中低保留杂质对Bα-La的干扰，对图5的液相方法Bα-La保留时间进行了调整(如图4所示)，Bβb-Lg和Bβa-Lg仍具有2.22的分离度。

方法的线性相关性及检出限
浓度分别为1.000、5.000、50.000、100.000 mg/L的三种乳清蛋白标准依次进样，进样量均为10μL，外标法定量。以峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标进行线性回归，分别得到Bα-La线性方程A=2.34e3×C-2.36e3，复相关系数R2=0.9997；Bβb-Lg线性方程A=1.32e3×C-1.30e3，复相关系数R2=0.9995；Bβa-Lg线性方程A=1.24e3×C-1.36e3，复相关系数R2=0.9987。三种乳清蛋白在1.000-100.000 mg/L范围有良好的线性关系(如图6-图8所示）。
并且经实验测定，方法检测限为1.000 mg/kg，图9为1.000 mg/L三种乳清蛋白标准色谱图，此浓度下Bα-La、Bβb-Lg、Bβa-Lg信噪比分别达到8、3和3，其中Bα-La可实现定量要求。

前处理方法讨论
前处理中有几个注意点，首先就是使用含0.2% Triton X-100的0.3M NaCl提取液，尽量不要超过3天，因为实验发现3天以后该溶液对乳清蛋白的提取和稳定效果会下降。其次样品加入提取液,调整pH后需要放置50分钟以上，因为发现放置和未经放置的样品，在离心后过滤膜时过滤的难易程度有较大差别，未经放置的虽较易过滤膜，但乳清蛋白提取率较低。
其关键点还在于提取液pH值的掌握，本文对同一奶粉产品在不同pH下的提取情况进行了比较，如下图所示，pH在4.4-4.6之间没有太大差别，但是pH达到4.8和5.0时，Bβb-Lg和Bβa-Lg的峰形变差，尤其是Bα-La的的出峰位置完全被杂质所淹没，因此实验中需要控制pH值不要超过4.6。

实际样品检测结果
图11-13分别为两种奶粉和一种液态奶实际样品分析色谱图及结果。

由图14，三种乳清蛋白的标准品、实际样品和样品提取液的空白溶液的重叠色谱图，可以看到，在奶粉和牛奶的提取溶剂中，不存在对样品中乳清蛋白分析物的干扰。另外参见下图15，是牛奶样品和牛奶样品最后添加标准品的色谱图，可以进一步定性牛奶提取样品中三种乳清蛋白的存在。

同时发现，乳清蛋白标准品用水或样品提取液(含Triton X-100的NaCl溶液)定容，进样检测对三种乳清蛋白的峰面积基本没有影响，图16是两种定溶液标准品的重叠色谱图。

重现性
5ppm标准品八次进样的重叠色谱图及重现性结果如下:

结论
本文建立了用Waters UPLC-TUV系统检测奶粉和牛奶实际样品中Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种牛乳清蛋白的定量分析方法。方法的检出限为1μg/g。使用Waters ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱和三氟乙酸添加剂流动相，使Bβb-Lg和Bβa-Lg两种遗传变异体可达到基线分离；采用280nm检测波长，有效降低了低波长检测下的流动相干扰，可以用于奶粉和牛奶中三种牛乳清蛋白的含量测定。

参考文献：
[1] Kinghorn N M, Norris C S, Paterson G R. Chromatogr A, 1995，700:111
[2] 蔡增轩,储小军等. 第十七届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集,KB02:23-24
[3] 李慧,陈敏等.色谱.2007.1,25:116-117
[4] Ena J M, van Beresteijn E C H, Robben A J P M, Schmidt D G. J Food Sci, 1995，60(1):104