由HPLC到UPLC的试验传输提高分析吞吐量

典型的HPLC试验经过传输和优化，用于沃特世的ACQUITY UPLCTM系统，以获得更高的样品分析吞吐量和更好的试验灵敏度。加速未来方法传输的策略已经形成。运营成本分析及试样处理量证明了UPLC相对于HPLC的成本优势。

       对较大制药分析吞吐量的需求的不断增加，促成了Waters ACQUITY Ultra Performance LC (UPLCTM)的诞生。该系统可以通过使用一种全新的细粒分离材料（1.7微米）和独特的化学性质来提供更快速的分析。
为了实现该物质的快速分离，色谱柱硬件及仪器的设计均在典型的HPLC基础上做了重大改进。UPLC的工作压力较高（可高达15,000 psi），将试样注入一个较小的系统间隙体积内，并以高数据率捕获检测器信号，以获得快速洗脱峰。一种全新的针型设计可根本减少有助于降低定量限（LOQ）的残留物。
在本项目中，用于质量控制（QC）的HPLC法经过优化以适应UPLC。考虑了减少总体运行时间、降低单位试验成本和增加仪器运行时间的策略。

方法开发
       原来的10分钟HPLC QC试验方法的制订是为了量化有机溶剂抽出物中杂环药物（Cpd A）的含量。通过一种内部标准（IS）来补偿样品制备损失，还需要有一个终端洗涤坡来消除后期洗脱干扰。
       最初的HPLC试验到UPLC的传输只是通过将一个比例因素应用于流动相流速和试样进样体积来完成的。该比例因素通过色谱柱横截面积的比值得出，以便保持流动相线性速度。 
       通过UPLC法得到的色谱波峰十分狭窄，分离度过大，表明有机会对方法进行改进。流动相流速上升，直到受到色谱柱反压力的限制。但是，后来进行的色谱柱使用寿命研究表明，通过增加有机溶剂含量来减少总体运行时间更为经济。溶剂的用量也显著下降。图1中的色谱将最初的HPLC法与初始规模和最终UPLC条件的进行比较。HPLC和最终UPLC方法的参数列于表1。

方法优化指南与观察结果
在优化UPLC方法的过程中，考虑到了加速日后方法传输的问题，并给出以下建议：
• 增加洗脱溶剂的强度，以减少运行时间，利用UPLC色谱柱的高分辨率潜力（参见表II）。
• 在增加溶剂强度的基础上增加流动相流速，以延长色谱使用寿命。当高分辨率的高流动相线性速度可以达到时（见图2），与任何色谱一样，以最大额定压力的80%进行的日常运行会缩短使用寿命。根据我们的经验，UPLC按8000 psi左右或更低的速度运行，每次试验的成本比HPLC显著降低。保持尽可能低的流速同样可以降低溶剂及废物处理成本，尽管这些已经比HPLC少了一个数量级。 

图1：色谱（由顶至底）：原始HPLC，至UPLC的初始规模显示波峰波形改善及进一步方法优化的可能性，及最终的UPLC方法。洗脱峰的顺序：内部标准（IS），然后是Cpd A。

• 通过利用低系统间隙体积来减少色谱重平衡次数。流动相中程式化的变化耗时到达色谱柱。小UPLC间隙体积（110微升，是HPLC的间隙体积的15%）允许部分简化原试验。色谱柱重平衡在UPLC中下一次样品加载过程中完成，进一步增加吞吐量。

• 适当减小进样体积，以便色谱直径达到良好波形。当强试样溶剂丸剂太大掩盖了色谱柱头部的填充时，会发生峰分裂。由于本试验方法可承受5微升进样，根据我们的经验，1-3微升的体积为更典型的起始点。注意，可以通过使用高分离度色谱柱来增强波峰高度和通过UPLC注射器的低残留物（大小为该分析物HPLC残留物的10%）来弥补较小的进样体积，以获得等同的或更低的LOQ。小进样体积的一个替代做法是降低试样溶剂强度来完成色谱柱头部的样品聚集。 
• 使用部分循环充注进样优先于全循环充注。部分循环充注精度即使在体积高达循环总体积的80%时也很高（图3）。
典型的试验方法是将试样体积进样限制在总循环体积的50%左右。UPLC进样系统利用了试样的气隙夹层，允许更好地利用试样循环和较高的进样精度，减少使用全循环充注模式的需要。 

图2：通过UPLC试验数据得到的Van Deemter方程图解曲线表明，使用高流速似乎是减少总体运行时间的一种策略。它需要与反压力对总体色谱柱使用寿命的影响进行平衡（见文本）。

图3：UPLC注射器中5微升额定值（实际为4.8微升）试样循环的部分循环充注模式产生的峰面积数据。对于标准注射器，在使用更低的循环速度时会像上述5微升进样中一样偏离于线性进样体积，所以，一般规定只加载循环容量的40~50%。

从实际角度看，全循环充注本质上要求较大的试样运动，同时考虑过充功能。这很可能增加后续的洗针工作，它会影响试样吞吐量和增加清洗硬件的磨损。较大的试样体积传输会增加试样颗粒的暴露机会，降低仪器的长期稳定性。
• 如果采用全循环充注模式，也许为了满足很高的精度要求，需要保证充分的循环过充。在UPLC注射器极其狭窄的针管内会在壁层和中心之间产生加载试样的层流速度差异。我们发现，要将洗涤剂从5微注射器循环中完全转换出来，至少需要过充样本循环达4个循环体积。对于该仪器，制造商已经为每个试样循环大小确定并设定了默认的最佳典型试样溶剂过充体积。操作人员可以为不常见的试样构成指定其它过充体积。
• 选择适当的弱洗样的构成和体积，以获得较好的波峰波形。一部分弱试样洗涤剂会与部分循环充注的试样一同注入。因此，弱溶剂洗涤应模拟流动相溶剂强度的初始条件。

图4：在0.054~1.30微克/毫升（R2 = 0.996，经1/X2加权）的较低浓度下浓度与峰值面积间的线性相关。

在试样循环中将弱洗涤剂作为样品稀释液可能会加强试样聚集在色谱柱上。弱洗涤剂的体积必须足以将先前的强洗涤剂从循环中清洗干净。
初步方法验证
       初步评价由新试验和线性度仪器、线性范围、精度、准度、系统适用性和试样残留构成。
线性度与最低定量线（LLOQ）
        由于UPLC潜在的较大的灵敏度，该试验的应用范围被拓宽，突出那些浓度差异达500倍的试样。相同的UPLC分离方法通过校准，发现对于二个试验范围均可接受地呈线性分布。有了54微克/亳升的LLOQ，小量程UPLC试验允许通过色谱-质谱来更典型地强调各种分析。值得注意的是，这款特别的UPLC系统还配备有光电二极管阵检测器。使用波长针对型检测器可以提供更小的定量限。
精度和准度
       按指定的浓度进行三倍进样，以评价精度和准度。精度通过波峰面积相对标准偏差（RSD）进行评价。 

1 验收标准：< 5.0%，全部通过。
2 验收标准：±5.0%，除最低浓度外：±15.0%，全部通过。

1 验收标准：< 5.0%，全部通过。
2 验收标准：±5.0%, 全部通过。

图5：在0.325~25.8微克/毫升（R2 = 0.999967，经1/X2加权）的较高浓度下浓度与峰值面积间的线性相关。

       准度是通过用校准曲线对进样波峰面积进行反向计算来得到每次进样的计算浓度来评价的。这些数值与理论值进行比较，并按照与理论值的偏差百分比（%）形成报告。大量程和小量程试验的结果均符合验收标准（见表III和表IV）。

1 1.30微克/毫升标准重复进样。

系统适用性
       共进行五次重复进样来评价系统适用性。结果通过了所有常用的USP验收标准（见表V）。
进样到查样试样残留
       仪器中以前试样的残留物造成进样的污染可设定一个试验的LLOQ的界限。频繁的残留会导致精度、准度和系统适用性试验的失败。然而，根据这些研究的协议细节，不可能揭示显著的残留效应。这里，我们直接测量残留物来预测潜在的浓缩及稀释混合试样中产生的误差。
       UPLC仪器具有减少试样残留的设计功能：一种全新的“针中针”注射器设计以及二种分离注射器洗涤剂。在本试验中，使用200微升甲醇进行初洗，以去除大部分有机残留物，然后用600微升水：ACN（90：10）来置换强溶剂，并使其余试样循环、针及阀门解决方案的构成与最初方法的条件相容。 
    

      此处，通过分析每次校正标准后的溶剂空白试样和测量分析物保持时间内出现的任何波峰的面积来评价残留情况。在五个低浓度标准进样后，未发现空白溶剂中有干扰波峰。对于最高浓度标准进样后的空白试样，噪波略上方的弱波峰的强度是上一次进样中分析物的0.01%。这在该试验中是可以接受的，尽管残留物可能已通过优化洗涤溶剂参数而进一步减少了。比较起来，HPLC系统的残留物要高出5~10倍。

总结
       定量表示有机溶剂提取物中杂环药物的QC HPLC试验已成功地传输和优化为UPLC。初步评价表明，该试验可以通过验证。 
       相关指南已经编制，以推动未来UPLC试验的发展。UPLC的应用具有成本优势。而每次分校的UPLC色谱柱费用明显少于或略少于HPLC，溶剂用量和废物处理费用应该降低一个数量级。若采用HPLC，试验时间会减少5倍，极大地提高了仪器投资回报率，并减少了所需的仪器总数。

参考文献
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