应用在线的SPE/LC/MS/MS技术分析牛奶中的药物残留

Claude R Mallet, Dimple Shah
Chemical Analysis, Waters Corporation, 34 Maple St., Milford, MA 01757-3696

概述
        世界各国为保证公民的健康安全，都时刻高度警惕。在当今的农业实践中，肉类动物养殖严重依赖药物的使用，这对于动物的健康和该产业经济状况是至关重要的。兽用药物或残留会进入人类食物，所以人们在使用了接受过药物治疗动物的产品后，会增加患病的风险。因而，许多政府机构已经规定了动物组织、牛奶和其它食物产品中各种兽用药物的最大残留量（MRLs）。
       与饮用水不同，食物产品中药物残留的分析需要复杂的样品提取和净化方案，以使基质效应最小化。但是，有一个主要缺点：就是需要大量的人力劳动以得到干净的提取物。一个典型的提取方案通常开始于将样品在水或有机缓冲液中混匀。然后离心、浓缩以及净化该混合物，而净化需采用各种提取技术例如液液萃取、分散技术或使用SPE等等。随着现在可用系统的发展，许多步骤都可以自动化，这就带来了直接的好处，减少了许多为得到最终提取物所需要的体力劳动。使用在线的SPE/LC/MS/MS系统，粗糙的提取可以被进一步精炼。
       此研究将展示在SPE/LC/MS/MS系统在牛奶的药物残留分析中的性能。牛奶样品先用乙腈（1：1的比例）沉淀蛋白，然后在3500rpm转速下离心15min。然后用3ml的水稀释收集到的上清液。稀释是为了降低有机相的比例到20%，以避免上样时流穿。
       所有体积（5ml）进样到在线的SPE/LC/MS/MS系统以富集、净化和分析。低ppb水平的结果显示了很好的信噪比。

大环内酯类抗生素 

离心SPE方案
步骤1：转移5ml牛奶到离心管
步骤2：添加15ml乙腈
步骤3：涡旋并且在3200RPM转速下离心15min
步骤4：转移乙腈上清液到第二个离心管
步骤5：添加20ml正乙烷
步骤6：涡旋15min
步骤7：在3200RPM转速下离心15min
步骤8：移去正乙烷层
步骤9：挥干乙腈上清液到3ml
步骤10：添加15ml0.1M，PH值为8.0的NaPO4缓冲液
步骤11：用10ml甲醇活化SPE
步骤12：用10ml水活化SPE
步骤13：用10ml2%的NACL溶液活化SPE
步骤14：用2ml0.1M，PH值为8.0的NaPO4缓冲液活化SPE
步骤15：上样复溶后的样品（步骤10）
步骤16：用5ml水清洗
步骤17：用5ml40%的甲醇水溶液清洗
步骤18：干燥SPE5min
步骤19：用5ml95%的甲醇水溶液洗脱
步骤20：挥干至干（45min）
步骤21：用1ml的起始流动相复溶
步骤22：用0.45μ的PVDF膜过滤提取物


在线SPE方案
步骤1：转移1ml牛奶到离心管
步骤2：添加20μL浓缩的氨水
步骤3：添加2ml乙腈（2：1的比例）
步骤4：涡旋并且在3500RPM转速下离心15min
步骤5：转移2ml的上清液到20ml的样品瓶
步骤6：添加18ml的水
步骤7：进样5ml

在线实验方案
载样泵：A：100%的水
B：100%的甲醇
载样/清洗/再平衡流速：4.0ml/min
清洗：20%的甲醇水溶液
洗脱泵：A：100%水+0.5%甲酸
B：70/30的乙腈/甲醇+0.5%甲酸
洗脱流速：0.4ml/min
再平衡泵：A：50/50的甲醇/丙酮
B：80/20的乙酸乙酯/丙酮
C：80/20的正乙烷/丙酮
萃取柱：2.1x20 Oasis HLB 25μm
分析柱：2.1x20 Xbridge C18 3.5μm

结果 

   图1：添加了0.5ppb的牛奶的提取色谱图

图2：罗红霉素的优化清洗

溶剂消耗和处理时间的对比

线形

图3：浓度范围从1到500ppb的红霉素的校正曲线图

结论
-完全自动化的提取和分析
-ppb以下的检测水平
-样品处理时间大约为20min
-人力劳动减少量高达90%
-宽PH值范围的SPE和LC吸附剂
-可使用化学的广发选择性
-高水平的重视性和耐受性

参考文献：
1. S.B Turnipseed, W.C. Andersen, C.M Karbiwnyk, M.R. Madson, K. E. Miller, Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: 1467
2. M. Dubois, D. Fluchard, E. Sior, Ph. Delahaut, J. Chromatogr. B. 2001; 753: 189
3. J. Wang, D. Leung, S. P. Lenz, J. Agric. Food Chem. 2006; 54: 2873