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不同蛋白提取液对动物组织全蛋白质组 鉴定的影响
2018/01/29 13:12
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方案摘要：
产品配置单：
赛默飞EASY-nLC 1200纳升级UHPLC
型号： EASY-nLC 1200
产地： 美国
品牌： 赛默飞
¥50万 - 100万
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方案详情：
目前利用高分辨质谱仪能够对细胞的全蛋白质组进行深度覆盖，鉴定细胞内接近全蛋白质组的蛋白数目，同时对于多种生物学过程中所涉及的翻译后修饰也能进行深度的鉴定和定量。质谱仪的能力和样品前处理是影响实验结果的两大重要因素，本文主要分析样品前处理过程中不同蛋白提取液对动物组织全蛋白质组鉴定的影响。
细胞裂解和蛋白质提取一般采取机械和物理两种方法相结合。传统的机械裂解如研磨、反复冻融、超声与溶液内剪切等对细胞进行破碎，为了提高蛋白提取效率，机械裂解的同时加入表面活性剂或变性剂，破坏细胞及细胞器脂膜同时增加蛋白溶解度[5]。常用的表面活性剂分为离子型、两性离子型和非离子型三大类，最常添加的非离子型表面活性剂有 Triton X-100 和 NP-40 二者可使蛋白质最小化变性；离子型的表面活性剂 SDS，可完全溶解细胞膜，蛋白提取效率最高，但蛋白质完全变性失活。常用的蛋白变性剂如尿素和盐酸胍，能够断裂蛋白氢
键，使蛋白发生不同程度的变性，同时增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度。因此根据实验目的、样品类型以及样品量选择合适的机械裂解与蛋白提取液，将有助于提高蛋白质组研究的深度。
通过这部分工作的摸索，我们得知对于 SDT 裂解液裂解细胞或组织时我们会采用探头超声来进一步促进细胞破碎，并且打断 DNA 来降低样品粘度。而对于 M-PER，T-PER，RIPA 等裂解液，我们发现探头超声对蛋白质鉴定数量的提高很有限，并且此时我们需要采用非常温和的超声条件，以免蛋白质变性后产生大量絮状沉淀。
四种全蛋白提取液中，SDT 的提取效果最好，但不适用于下游活性蛋白相关实验。在进行蛋白质浓度测定时由于SDT 裂解液中含有 SDS 和 DTT，因此 Bradford 法和 BCA 方法不适用，而应选择去垢剂和还原剂均兼容的荧光法测定蛋白质浓度。各种裂解液中含有的去垢剂均会影响胰蛋白酶活性，并且对质谱分析产生很大影响，因此均需要在蛋白质样品酶解前除去。不同的去垢剂也均有不同的去除方法，包括常用的超滤和丙酮沉淀等。
在进行各种各样纷繁复杂的蛋白质组学实验时，我们需要根据我们具体的实验目的来选择合适的裂解液和裂解方法，才能保证我们后续实验顺利进行，并且获得可信的结果。
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