赛默飞：病毒感染中基于代谢及脂质组学的亮点研究成果

仪器信息网讯 2020年，新型冠状病毒肺炎在中国和国际的迅速传播引发了全球卫生紧急情况。仪器信息网在密切关注疫情发展态势的同时，也更加关注病毒感染的致病机理等相关研究进展。近年来，组学研究成为生命科学基础研究领域的重点，对于病理、毒理学、药物动力学等具有重要价值，相关高水平学术期刊大量报道了科研人员利用组学技术开展的病毒致病病理学的研究成果，也对于此次疫情的进一步研究具有一定参考意义。

基于此，仪器信息网推出了“组学技术在病毒感染致病机制中的亮点研究及技术进展”专题，为广大业内专家及用户介绍基于蛋白组学或代谢组学等多组学技术在病毒感染致病机制中的研究应用及技术进展，增强业界专家与仪器企业之间的信息交流，提供更丰富、更专业的技术文章，谨以此致敬所有奋战在抗疫一线的白衣天使以及幕后深耕的研究学者。

新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染的新型肺炎（COVID-19）疫情正在全世界范围内持续蔓延，引发的感染人数不断增加。截止到目前，全球感染人数已近300万，每天新增报告人数超过8万。由此疫情引发的社会影响不但扩大，让人们再一次感受到传染性病毒研究的紧迫性。

科研界已有大量研究论文对SARS-CoV-2 病毒基因结构特点，COVID-19的流行病学和临床特征进行了较为系统性的研究。然而，SARS-CoV-2 病毒进入人体后，如何引起体内代谢水平的变化，以及这些变化如何影响患者及预后水平尚未可知。代谢组学和脂质组学技术作为精准医疗研究的重要组成部分，在中东呼吸综合征，埃博拉病毒，SARS-Cov-2等病毒研究中体现出重要价值，帮助研究人员确定病毒侵染宿主后代谢物的变化，阐明致病潜在机制、寻找诊断生物标志物，以及疾病分期分型等^[1]。

因此，采用代谢组学和脂质组学技术研究SARS-CoV-2对机体系统的损害及其潜在机制，可以帮助研究人员更快的发现药物靶点，开发诊断和预后评价生物标志物，以便及时诊断，有效地治疗COVID-19患者，并降低死亡率。本文中将对病毒感染中基于代谢组学和脂质组学的代表性研究成果和进展做简要的介绍。

1.   基于Orbitrap的多组学技术研究新冠肺炎轻重症患者分型和生物标志物

根据新冠状病毒感染的肺炎诊断和治疗计划，患有合并症的老年人更容易感染SARS-CoV-2，尤其是那些患有高血压，冠心病或糖尿病的人。 此外，CVD患者如果感染SARS-CoV-2，则更有可能出现严重症状^[2]。另据世界卫生组织调查，新冠肺炎患者大约80%患者症状较轻，14%左右发展为严重疾病，5%左右属于重症病例，其中，重症患者的死亡率超过50%。

在临床治疗中，为什么轻症患者会在短时间内迅速演变为重症成为急需解决的难题之一。国内西湖大学生命科学学院郭天南教授与合作团队，采用Q Exactive HF-X和 Q Exactive HF质谱分别对新冠肺炎患者血液中的蛋白质，代谢物和脂质进行系统考察，研究结果以预印本形式发表在2020年4月在medRxiv杂志上^[3]。

研究人员发现，新冠肺炎重症患者的样本中出现了93种特有的蛋白表达和204个特征性改变的代谢分子。这些变化中，可以发现100多种代谢物和100多种脂质均出现显著下调，而21-羟基孕烯醇酮增加，犬尿氨酸通路被激活；鞘脂，胆碱，甘油磷脂等脂类分子降低显著。这些代谢物的变化与患者体内的巨噬细胞、补体系统、血小板脱颗粒有关。并通过机器学习分析方法，整合蛋白质组、临床、生物、代谢组、计算等多学科数据筛选出重症患者特征性的22个蛋白质和7个代谢物。这些体内分子水平的变化，为临床疾病分型，重症病人的早期诊断，以及治疗手段提供理论依据，有望为预测轻症患者向重症发展提供导向。

图1a: 新冠肺炎轻重症患者差异性蛋白，代谢物，脂质

图1b:机器学习预测重症患者

2. 基于Q Exactive代谢组学技术研究免疫应答的过程

目前全球共有数十个科研团队在加紧进行针对新冠病毒的疫苗研发工作，中国和美国已经有一些项目进入临床试验，期望更早一步将研究成果应用到健康人身上。根据临床经验，疫苗虽然可以预防许多疾病，但不同人群接种同一种疫苗后，所产生的免疫反应和预防效果也有很大的不同。2017年发表在Cell 杂志的一项研究表明[4]，小分子代谢物对免疫细胞的增殖分化及其功能息息相关。整合转录组学和代谢组学研究显示，代谢反应是人类对带状疱疹病毒疫苗的免疫反应有效性的基础。

图2:接种疫苗后，体内免疫应答过程

研究人员开展了病毒疫苗接种在健康成人上的纵向研究，分别收集接种前和接种后的血液进行转录组学和代谢组学分析。研究结果显示，接种疫苗后第1天起，嘌呤代谢，亚油酸代谢、蛋氨酸和半胱氨酸代谢、甘油磷脂代谢和糖磷脂代谢等于转录组学密切相关。并构建MMRN网络，结合接种者年龄、性别和病毒载量相关的网络来预测有效性，揭示甾醇代谢基因和代谢物之间的联系，而磷酸肌醇代谢提供了代谢表型，影响免疫结果。

通过此项研究，可以帮助研究人员对疫苗接种的免疫反应进行情境分析，确定影响疗效的相关因素，同时为免疫反应提供新的生物学见解，促进未来的生物标记物研究和疫苗开发。

3.机制研究助力广谱抗病毒药物的研发

SARS-CoV-2 病毒引起的严重疫情的主要原因，除了和病毒本身传播力强有关之外，也与尚未有获得批准的特定药物或疫苗因素有关。而全球医疗体系在冠状病毒治疗药物方面还处于非常被动的层面。采用组学技术研究病毒侵染人体后，机体代谢水平的变化及其机制的研究，可以发现病毒侵染人体的代谢通路。为发现抗病毒新药靶点，以及广谱抗病毒药物的研发提供依据。

病毒在侵染机体的过程中，需要利用宿主的新陈代谢，通过重构宿主的代谢途径进行复制。核苷酸，蛋白质和脂质合成是病毒侵染宿主的主要物质基础。研究人员通过培养SARS-CoV-2感染的组织细胞，雪貂和COVID-19已故病人样本表明，病毒感染会显着抑制NAD代谢组，雪貂和人类的SARS-CoV-2感染下调了色氨酸和烟酸（NA）的NAD合成，同时上调了烟酰胺（NAM）和烟酰胺核苷（NR）的合成能力，这可能会给细胞带来巨大压力。基因表达和药理学数据表明，通过烟考酰胺和烟酰胺核糖苷激酶途径增强NAD +可能恢复抗病毒PARP功能以支持对SARS-CoV-2的先天免疫[5]。这一研究成果与西湖大学研究团队不同，可能与选择的模型和疾病所处的分期有关。

图3: SARS-CoV-2 感染后体内NAD+等代谢变化

 Nils C. Gassen等对SARS-CoV-2控制的自噬的分析表明，亚精胺，MK-2206和烟酰胺可能是潜在有效的抗病毒药物。既有研究显示，基于自噬等新陈代谢相关的方法显著降低了高致病性中东呼吸综合征（MERS）-CoV的传播。

图4: SARS-CoV-2 影响的主要代谢通路

研究人员发现，SARS-CoV-2感染通过干扰多种代谢途径来限制自噬，采用化合物干预手段来干预自噬过程，可降低SARS-CoV-2 在体外的传播。自噬信号传导和代谢组学技术深入分析表明，SARS-28 CoV-2通过限制AMP蛋白激活激酶（AMPK）和雷帕霉素复合物1（mTORC1）的激活来减少糖酵解和蛋白翻译，减少自噬。病毒感染会下调自噬诱导的亚精胺合成，促进自噬引发的Beclin-1（BECN1）的AKT1 / SKP2依赖性降解。 通过外源给予亚精胺，AKT抑制剂MK-2206，Beclin-1稳定剂，烟酰胺可抑制SARS-CoV-2的传播^[6]。

4.赛默飞代谢组学和脂质组学技术方案

由于代谢组学样本的高度复杂性和代谢物的特征，研究者在病毒研究中遇到了诸多的挑战，特别是提高代谢物组覆盖率，更高的灵敏度诉求、大队列研究中的稳定性和重现性，代谢物鉴定等方面一直制约着代谢组学学科的发展。要想获得高质量、高准确度的分析结果，对平台技术的建设和提升无疑也是极为重要的。

赛默飞作为生命科学仪器领域的领导者，致力于帮助科研人员收获代谢组学和脂质组学技术在病毒研究中的作用，深度探究病毒侵染宿主的代谢分子变化机制，加速生物标志物和抗病毒药物的发现。我们已在色谱分离、质谱检测与生物信息软件等方向构建了非常有特色的完整解决方案。

解决方案包含四部分：（1）推荐的样品制备方法；（2）不同色谱分离手段：如LC（亲水性的HILIC、疏水性的C30和常规C18）、GC和离子色谱构成；（3）质谱检测平台：由定性定量的Orbitrap平台（Q Exactive 系列、Exploris 480，Fusion系列），以及三重四级杆系列（TSQ Altis、Quantis）构成；（4）数据处理平台：由侧重非靶标代谢组学和代谢流的Compound Discoverer软件、脂质组学软件LipidSearch，以及大规模代谢物靶向定量的TraceFinder软件组成。

图5：赛默飞代谢组学解决方案

4.1 特色解决方案1：离子色谱解决极性大代谢物分析难题

作为病毒侵染宿主重要的物质，糖酵解途径代谢产物、三羧酸循环代谢产物，NAD+以及核苷酸代谢物，因其重要的生物学功能，在代谢组学研究中越来越受到重视。以往这类化合物的检测，研究者多采用GC-MS技术，但由于这些代谢物的极性强、挥发性低，往往需要进行衍生化处理，大大增加研究者的工作量和数据挖掘过程中的不确定性。离子色谱作为液相色谱的一种，对糖类、氨基酸、核酸、有机酸等物质的分析起着重要的作用^[7]。

图6：糖酵解途径中单磷酸糖类离子色谱研究

4.2 特色解决方案2：稳定同位素标记技术（代谢流组学）

传统代谢组学分析的结果不能提供有关细胞内代谢率和代谢途径活性的信息^[8]。例如，丰度的变化提高可能来源于上游物质产量的增加，但也可能来自于下游物质消耗量的减少。同时应注意的是，生物体内的代谢物来源可能存在多条路径，因此代谢物丰度的变化也可能来源于已知或未知的代谢通路。因此，单纯从代谢物丰度变化的显著程度来解释疾病发生发展的过程，存在很大的不确定性。

确定代谢物在代谢途径中的作用的最有希望的方法之一是“稳定同位素”示踪剂跟踪其去向^[8]。通过稳定同位素标记的葡萄糖或谷氨酰胺（含有 13C、15N），检测下游代谢物的稳定同位素标记的状态，代谢流量等参数，深度挖掘代谢物的精确流向，可提供相关代谢物在某一流路的动态变化信息。这项技术已成为近年来的研究热点技术之一，在肿瘤、糖尿病等疾病机制研究中大放异彩。

多项研究表明，仪器的质量分辨率在代谢流研究中起着非常重要的作用^[8-9]。足够高的分辨率和质量精度可以排除背景离子干扰，从而在未知代谢物发现和代谢途径方面获得更好的结果。Demo实验室采用含有稳定同位素标记的 13C6葡萄糖和^[13] C5 ^[15] N2谷氨酰胺培养基中培养MDB-MA-231细胞， 24小时后检测样品中三磷酸腺苷（ATP）含量的变化。 随着仪器上的MS分辨率增加，同位素峰变得更加明确，13C和15N双标记的同位素代谢物在更高分辨率下得到基线分离。结果表明，高分辨率和稳定的质量准确度是准确分别同位素标记代谢物的重要因素，帮助更准确的示踪复杂样品中的代谢物同位素，确认代谢途径。

图7：超高分辨率在区分ATP精细同位素上的重要性

4.3 特色解决方案3：脂质组学

我们看到在新冠病毒肺炎研究中，脂类发生了非常显著的变化。脂质组学作为一门新兴的研究学科，其成果对科学家深入理解细胞生理和病理过程十分重要。作为代谢组学的重要分支，脂质组学在研究细胞凋亡、信号传导、疾病感染、免疫功能、新生儿代谢缺陷等方面起着重要的作用^[9]。脂类化合物的代谢还与糖尿病、肝癌、肾病、乳腺癌密切相关^[10-12]。“十三五”重大项目指南，国家自然科学基金委员会等重大项目指南中，均把脂质研究列为重点研究专项，期望通过特异性脂质生物标记物的分析，我们有希望区分健康人群与患病风险人群，进行疾病早期诊断，为脂代谢紊乱疾病的预防和治疗提供理论基础 ^[10]。

赛默飞和业内科学家紧密合作，在脂质组学应用中开发了完整的靶标和非靶标脂质组学分析流程，配合LipidSearch 专业脂质组学数据处理软件，可以快速实现脂质分子的自动鉴定和相对定量。

图8：赛默飞脂质组学方案

我们期望通过全球各个国家和各个行业的共同协作，在攻克新型病毒上努力行动。作为赛默飞的成员，希望通过本文基于Orbitrap的多组学技术在SARS-CoV-2 研究进展的梳理，帮助一线的医务工作者和科研人员更好的发力，早日战胜这场疫情。谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者。

参考文献：

1.  Beger R D , Dunn W , Schmidt M A , et al. Metabolomics enables precision medicine: “A White Paper, Community Perspective”[J]. Metabolomics, 2016, 12(9):149.

2.  Zheng YY, Ma YT, Zhang JY, Xie X. Nat Rev Cardiol. COVID-19 and the cardiovascular system. 2020 May;17(5):259-260. doi: 10.1038/s41569-020-0360-5.

3.  Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera.https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.07.20054585v1

4.  Li S, Sullivan NL, Rouphael N, et al. Metabolic Phenotypes of Response to Vaccination in Humans. Cell. 2017;169(5):862–877.e17. doi:10.1016/j.cell.2017.04.026

5.  Coronavirus Infection and PARP Expression Dysregulate the NAD Metabolome: A Potentially Actionable Component of Innate Immunity

6.  N. C. Gassen et al., SKP2 attenuates autophagy through Beclin1-ubiquitination and its 235 inhibition reduces MERS-Coronavirus infection. Nat Commun 10, 5770 (2019).

7.  Wang J, Christison TT, Misuno K, et al. Metabolomic profiling of anionic metabolites in head and neck cancer cells by capillary ion chromatography with Orbitrap mass spectrometry. Anal Chem. 2014;86(10):5116-24

8.  Johnson CH, Ivanisevic J, Siuzdak G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016;17(7):451-9

9.  Vaz FM, Pras-Raves M, Bootsma AH, van Kampen AH. Principles and practice of lipidomics. J Inherit Metab Dis. 2015;38(1):41-52

10.  刘虎威,白玉.脂质组学及其分析方法[J].色谱,2017,35(01):86-90.

11. Jiang Y, Sun A, Zhao Y, et al. Proteomics identifies new therapeutic targets of early-stage hepatocellular carcinoma. Nature. 2019;567(7747):257-261

12.  Garcia-Bermudez J, Baudrier L, Bayraktar EC, et al. Squalene accumulation in cholesterol auxotrophic lymphomas prevents oxidative cell death. Nature. 2019;567(7746):118-122

投稿来源：赛默飞色谱与质谱