奥运话题:较量 兴奋剂检测中生物技术(下)

      赛默飞世尔特约 生物通撰稿

      续前 奥运话题:较量 兴奋剂中的生物技术(上)

五 科技进步助力兴奋剂检测：高分辨率的检测方法。
       运动员和教练在金牌的面前无法抵御住诱惑的时候，严格精确的反兴奋剂检测将是还给运动员公正、公平的唯一砝码。

　　兴奋剂检测，难度高，责任重大。首先，违禁药物及其代谢产物的种类多，变化大，禁用的百余种药物以原体或一个或多个代谢产物的形式存在与人体体液中，需要检测和确证的化合物多达140种。其次，药物在人体体液中的浓度很低，用药时间的长短也影响这些化合物的浓度变化，直到排出体外，要检测出尿液中纳克（即十亿分之一克）或更低的水平的代谢产物，准确的定性和定量，对检测的灵敏度要求很高。再者，部分禁用药物本身也是人体内源成分，需要在极其微量之中区分内源和外源之别，难上加难。

　 随着奥运会的临近，许多陈年兴奋剂丑闻再度浮出水面，索普、乌尔里希、兰迪斯，琼斯，格林，这些曾经显赫辉煌的名字如今都被打上了一个个问号。这不禁让人产生联想——北京奥运会将如何保证公平公正的比赛环境？奥运会不仅是体育水平的较量，也是一个国家科技水平的展示。在奥运会赛场外进行的这番较量中，中国人如何向世界显示自己的实力？带着这些问题，生物通记者采访了创建中国反兴奋剂中心创建人之一，中国药学发展奖药物分析奖获得者：王慕邹教授。

　 王教授深情回忆起1986年到1989年期间，为迎战1990北京亚运会，在只许成功不许失败的巨大压力下，药物所毅然接过了兴奋剂检测中心筹建项目，仅用3年时间，和体委的同志一起，在药物所大院墙根边的简陋房子里，从无到有，从一片空白中建立起一个国际奥委会8次检查全部一次通过的A级兴奋剂检测实验室。如今的迁往奥运会新址的中国反兴奋剂中心早已今非昔比，连续16年通过国际反兴奋剂组织的考试，水平和设备已经是国际一流水平。

　 国家体育总局运动医学研究所副所长、中国反兴奋剂检测中心副主任吴侔天表示“2008年北京奥运会的兴奋剂检测的重点是提高常规检测灵敏度的技术，以提高检测的准确率和简化教程。”据报道，2004年雅典奥运会上就有几名国外运动员在自己国内未被检测出来，但到雅典就被检测出呈阳性的事件。这就是国家自己的检测系统灵敏度不够，给了运动员一个错误的信息。要保证2008年中国代表团在家门口比赛不出服用兴奋剂的丑闻，就必须提高常规检测的灵敏度，改进自己的检测方法。虽然这不是突破性的技术，但却可以保证中国代表团真正实现公平、公正、公开的体育精神。

　　另外一个问题是检测速度。如果金牌都发到运动员手中了，检测结果才发现运动员服用违禁药品，会让本来庄严的奥运会变得有些像闹剧。2000年悉尼奥运会虽然解决了通过血检的方法检测EPO，但这种方法准确率不高，还需要通过尿检来确定，但尿检的过程太复杂，共有187个步骤，且都需人工完成。如何简化这个过程，如何准确高效地检测，成为2008年北京奥运会迫切需要解决的问题。

      当前兴奋剂检测主要靠液相和气相色谱仪来分离和筛查样本中的化学成分、常规质谱仪筛查化合物的质谱指纹图，必要时通过高分辨质谱来进行确认和定量。王教授介绍说，20年前的兴奋剂检测还只靠液相和气相色谱，以及气相色谱-质谱联用，不挥发的成分还难以检测，内源性和外源性的激素类物质的分辨还需要通过相当复杂的计算；如今即将迎战北京奥运会的中国反兴奋剂检测中心，为应对史无前例的4500例奥运会兴奋剂检查，不仅配备了当年尚未成熟的液相色谱-质谱联用，还配备了更高效更强大的武器：高分辨磁质谱和同位素质谱。

先进武器

　　尿检取样后，尿样进入实验室经过pH值和尿比重测定，首先是按四类大药物分成四组对所有的样本进行筛选分析。要在短短10多天的时间内准确筛选分析至少4500例样本，中国反兴奋剂检测中心此次专门购入的赛默飞世尔科技全新TSQ Quantum Access三重四极杆液质联用系统以应对数以千计的复杂而多样的样品和巨量检测任务。新设备可同时提供定量分析和被测物离子谱图进行化合物鉴定，其优化的离子源离子化更彻底，有效提高检测灵敏度和耐受性；加上样品通量高，选择性高，速度快时间短，稳定性好，还特别加强了定性能力，扩展了可分析成份的质量范围, 可对超过300种不同被测物进行多化合物扫描，进行多组分筛选分析同时进行定量和结构确证，使之更能适应在兴奋剂检测的苛刻要求----多达140种违禁药物及其各种代谢产物的快速筛选检测需求。

　 快速筛选中一旦发现有阳性结果的样品，即需要马上进行该药物的确认分析。如果说前面的筛选分析结果阳性只有7成把握，那么后面的确认分析就必须准确定性和定量，保证99%以上的准确性。要知道，一旦公布兴奋剂检测结果阳性，运动员可谓身败名裂，运动生涯，荣誉，前途，统统灰飞烟灭，准确可靠的检测结果，其重要性不言而喻。在万众瞩目的奥运会赛场上，检测结果更加不容差池。

　 为此，中国反兴奋剂检测中心虽然已有MAT95高分辨率质谱和Delta同位素质谱，为北京奥运会还专门从赛默飞世尔购入更加强劲的武器：最先进的DFS GC/MS高分辨磁式气相色谱和质谱联用仪和Delta V GC/MS/IRMS同位素质谱系统，以承担2008北京奥运会反兴奋剂确认分析的任务。

　 DFS高分辨双聚焦磁质谱不同于以往型号的高分辨磁质谱仪，采用了最新的离子光学理论，是15年来第一台完全新型的双聚焦质谱仪。DFS新颖的磁场和电场分析器设计提供目标化合物的最高灵敏度，常规分析飞克数量级(10-15)目标化合物轻而易举。DFS高分辨率质谱仪灵敏度一直居于行业领先，超过其他同类产品８～９倍， 可轻松应对尿检中少至纳克级甚至更低的代谢产物的准确定性和定量，更大程度保证定性和定量检测结果准确性。高度自动化程度，大大减少人为操作误差的可能。为了提高检测中心在奥运期间的工作效率，应对大批样品的检测任务，北京反兴奋剂检测中心采用了赛默飞世尔独有气相色谱-高分辨率质谱联用技术，为DFS高分辨磁质谱还专门配备了2台气相色谱作为“助手”，通过二台气相色谱交替为ＤＦＳ高分辨率质谱仪提供样品，节省了气相色谱走完程序升温后必须冷却才能为下一个样品进样的准备时间，从而提高了工作效率。

还刘国梁清白 同位素比质谱立大功
    睾酮是最常见的类固醇兴奋剂之一，睾酮的检测比较麻烦，不论男女尿中都有内源性睾酮排出，兴奋剂检测中对是否滥用睾酮的检测主要依据尿液睾酮和表睾酮的比值(T/ET)来间接地判断运动员是否使用过睾酮(T/ET>4即为阳性)。瑞典卡罗琳斯卡学院的燕妮•雅各布松•舒尔茨博士和她的同事在《临床内分泌学和代谢》杂志上发表的一份调查报告显示，UGT2B17基因编码的酶可控制睾酮葡萄糖酸苷（简称TG）的生成，而在携带2个正常UGT2B17基因的个体中14%的人不用服任何禁药检测结果已经超标，携带失活UGT2B17基因的人有一半即使按标准剂量服用外源激素后依然可以蒙混过关。违禁药物中不少成分属于内源性激素或多肽，如何准确区分内源性和外源性激素，这对兴奋剂检测技术提出非常高的要求。

　 北京反兴奋剂检测中心为此专门配置的高灵敏度的DELTA V 同位素质谱仪能达到前所未有的高灵敏度。同位素比质谱在分辨内源性和外源性激素上有无可比拟的优势，可辩别出尿中的睾酮是内源分泌的，还是外源加入的。准确率接近100%，DELTA同位素比质谱仪在过去的兴奋剂检测中可立过大功。

　 1999年马来西亚世乒团体赛发挥失常的刘国梁在男团决赛中输掉2场比赛而导致中国队痛失的男团冠军奖杯。有消息称刘国梁失常原因是因为早前单项赛中兴奋剂检查阳性，一时闹得满城风雨。乒乓球是中国的骄傲，难道大国手也要靠兴奋剂？作为中国人简直难以接受。直到2000年乒协正式澄清，刘国梁在1999年荷兰举行的世乒赛单项赛上尿样检测中表睾超标。表睾本身对运动员的能力没有任何影响，是一种睾酮类固醇激素的掩盖剂，幸亏借助同位素比质谱，包括洛杉矶大学实验室在内的多家国际一流的兴奋剂检测中心对刘国梁的尿样进行了多次检测，最终得出的结论是刘国梁表睾超标是自源性的，即其自身基因内分泌的结果，与违禁药物无关。若非同位素比质谱立功，说不定我国乒坛就要无辜折损一员勇将，今天优秀的国家队教练员中也许会少了刘国梁大名了。

　 清者自清，浊者自浊。同样是睾酮检测，去年环法自行车赛又出兴奋剂丑闻，位于夏特奈的法国反兴奋剂实验室使用DELTA同位素比质谱仪对意大利车手莫雷尼的尿液进行了检测，发现检测出的睾酮并非莫雷尼自身产生的，而是服用了合成睾酮。莫雷尼被车队开除并被勒令退出此次比赛。

　 有了高科技助力兴奋剂检测，赛场上的公平才有了坚实的科技基础。
　
六、基因兴奋剂
遗传突变打造冠军
       连续3届奥运会成为芬兰英雄的越野滑雪运动员门蒂兰塔先后共获3枚奥运金牌和2银2铜，世锦赛2金2银1铜，赛后发现其血液中红细胞数目比其他人高20%以上，30年后，科学家在调查了门蒂兰塔家族多达200人的血液样本后发现，包括门蒂兰塔在内的50多人携带促红细胞生成素基因突变，使他体内红细胞数比正常人多20％，供氧更充分而使他在比赛中滑雪速度快、耐力持久。这，我们称之为“运动天赋”。

人造天赋
　 2004年美国宾夕法尼亚大学Sweeney等人发表文章，通过在小鼠骨骼肌中表达胰岛素样生长因子（IGF-1）可在不影响其他组织器官的情况下增加小鼠骨骼肌20%-50%，肌力也大大增强，且不影响血液循环中的IGF-1水平而产生其他危险。该成果有望用于治疗重症肌营养不良患者。由于外源基因进入体内后的表达产物和自身表达产物均可视作内源而无法区分，用于运输基因的AAV病毒载体也是人体常见的携带病毒，因而可能成为最隐蔽的兴奋剂。文章发表后作者收到大量来自病人和健康运动员的咨询。

    随着生物技术的突飞猛进，以基因疗法的方式改造遗传背景、改造血液和改造肌肉，提高力量和耐力爆发力，人造天赋在理论上已经没有什么不可能了。实际上,基因研究和体育的关系越来越紧密。迄今已发现100多个与增强肌肉和肺活量有关的基因。新一代测序平台将人全基因组测序的成本降到6万美元以下，解析优秀选手的基因,比较其碱基对和正常人的差异，已经不是天方夜谭。但是，针对基因兴奋剂的检测方法还没有定论。

    但是，早在1990年开始备受追捧的基因疗法，目的是通过转基因的方式将外源基因导入携带严重基因缺陷的病人体内，以期修复原来缺陷的基因，表达原来缺失的蛋白产物。基因疗法既有成功治疗重症单基因缺陷患者的记录，也因为转基因载体导致患者治疗基因缺陷的同时却患上癌症而遭受重大挫折。这种原本用于造福带有严重基因缺陷病人的新技术，依然还在重重挫折和困难中艰难前进的时候，却也许会被毫无保障的用于健康的年轻生命上以谋取荣誉和利益，这无疑是生物技术发展下的意外副产物。

　 基因兴奋剂已经被列入世界反兴奋剂组织的违禁名单中，但是目前尿检和血检均不能有效查出，相关的兴奋剂检测方法还有待开发。高科技的发展一方面不停地给兴奋剂检测提供最先进的“武器装备”,另一方面也不断给反兴奋剂斗争增加难度。2004年后有大量的媒体报道“基因兴奋剂可能挑战北京2008奥运”，是否会成为现实？我们不得而知。

小鼠要登珠峰 基因兴奋剂检测新动向

生物通最新的消息是美国著名的宾夕法尼亚大学受反兴奋剂委员会和核酸纯化领域著名的QIAGEN公司赞助联手研究检测基因兴奋剂的方法。按照计划，将让活的小鼠登上珠穆朗玛峰，检测在在珠峰的极端条件下缺氧促进EPO生成时的分子特征，以研究天然条件下和基因兴奋剂条件下诱导产生的分子的异同。

“在相关问题搞清楚之前,谈基因兴奋剂的检测不太现实。”国家体育总局运动医学研究所副所长、中国反兴奋剂检测中心副主任吴侔天表示，不到北京奥运会开幕,不能排除有新检测项目的可能性。但是毫无疑问，生物技术在这赛场外的兴奋剂和反兴奋剂之间的较量中，扮演了最主要的角色。

　 世界一流的A级反兴奋剂检测实验室，世界一流的仪器装备，久经考验的最勤奋的工作人员，2008北京奥运会赛场之外的较量，即将开战，让我们拭目以待。(生物通吴青)