BioLC生物液相---可分析蛋白/核酸/糖/氨基酸和小生物分子的液相
2002-07-22 00:00
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资料摘要:
生物液相色谱和氨基酸直接分析技术
生物液相主要应用
糖类
带积分安培检测的高效阴离子色谱可以直接定量测定
以下物质:
l 糖蛋白 单糖和低聚糖
l 唾液酸
l 发酵培养基和食品中的氨基糖和乙二醇
l 多聚糖
氨基酸
生物液相氨基酸分析仪(AAA-DirectTM)的配置可对以
下物质直接测定(无需柱前和柱后衍生):
l 发酵液,细胞培养液,体液和食物.饮料中的
氨基酸和糖
l 蛋白质水解中的氨基酸、糖和氨基糖图谱
蛋白质和肽
高性能的色谱柱配合淋洗液自动发生装置使分离效果
大大提高:
l 监视由于唾液酰化作用,羧基末端截断,氨
基末端焦谷氨酸结构,天冬氨酸的脱酰胺作用,以及色
氨酸和蛋氨酸的氧化引起的蛋白质成分的差异.
l 绘制肽图
核酸
在多种变化条件下分析核酸
l 正常的(8-30mer)和超长的(30-70mer)寡
核苷酸单碱基的不同
l 超螺旋质粒和线性DNA的分离
l 聚合酶链反应产物和硫代磷酸(抗制敏寡
核苷酸)分析
小生物分子
生物液相离子交换柱和超级检测技术的结合给以下物
质的分析提供了最高的分辨率和灵敏度
l 肌醇磷酸
l 生物活性胺
l 体液中的有机酸和无机离子
l 维生素
l 抗生素
BioLC--可以满足全部生物液相需求的系统
生物液相
在为生物分子分析提供最佳色谱设计中,戴安公司突
破了其它高效液相系统的极限。使用惰性、非金属的
PEEK流路,消除了对生物相容性和腐蚀的担心,使用
者可以很自由地为分离选择最好的缓冲液。生物液相
系统提供了具有最大灵活性的模块组件设计。
自动进样器
AS50自动进样器具有一个经校验的可移动的注射针,
对少到1μL体积的样品量仍可保证很高的注射精度准
确度。可变的注射体积减少了样品稀释的需求,并且
提供稳定的操作,相对标准偏差小于0.5%,珀尔帖制
冷可保护不稳定的样品。AS50最多可存放100个1.5ml
的样品瓶。
色谱箱
色谱箱内有进样阀,柱选择阀,分析柱,保护柱和检
测池。所有组件均设计成最小的死体积。精确的温度
控制适合对温度敏感的样品的应用。
优良的泵系统
GS50是生物液相系统首选的泵系统。全PEEK流路的双
柱塞串联梯度泵,适合使用2-4.6mm的色谱柱;该泵
可以提供平滑的、无脉冲流动以及精确的比例和优良
的流动精度,可满足敏感、稳定的生物液相的要求;
泵的死体积小,可提供精确的梯度。
多种检测器
生物液相系统可以使用3种检测器。检测器可提供优良
的信噪比和在广的研究范围内最大的灵敏度。每个检
测器均提供友好的用户服务诊断和屏幕简单校正。利
用PeakNetTM数据管理软件可进行全自动检测。
ED50电化学检测器
ED50是一个功能强大的并且多用途的检测器,提供三
种模式的电化学检测。它可以提供脉冲安培、直流安
培和抑制型电导检测。
直流安培
直流安培检测器是高灵敏度检测器,适用于苯酚、儿
茶酚胺、氰化物、硫化物、碘化物和其他分析物的应
用。连续直流电压作用于工作电极进行电化学氧化或
电解目标分析物。通过测量电化学反应的电流达到定
量分析。
脉冲安培
为避免直流安培电极被糖污染,开发了脉冲安培检测
器,脉冲安培检测利用依次重复的四重脉冲电位可以
使电极表面保持清洁并确保检测器的连续响应。氨基
酸、乙醇、甘醇、醛类和烷醇胺都可以通过该种方法
检测。脉冲安培检测(PAD)可提供高的灵敏度和特异
性,无需衍生反应。
抑制型电导
电导检测器用于检测无机阴、阳离子如:CL-、SO42-
、F-、Na+、K+ ,也可检测有机离子如:有机酸、磷
酸和胺类。生物液相独有的离子交换柱配备抑制型电
导检测模式可以进行极低含量的检测并具有非常高的
灵敏度。
AD25 紫外可见检测器
紫外可见吸收检测器是应用于蛋白、多肽、核酸、维
生素或其他生物小分子的非常常规的检测器。AD25检
测器是具有双光束、多波长的光度计,波长范围190-
800nm。配备先进的纤维光学技术可提供简单可靠的操
作;内置的氧化钬自动波长矫正功能,可获得更好的
准确度;非金属流路可消除由金属引起的生物分子变
性;前开门方式便于对检测器中的氘灯、钨灯和流通
池的维护。
PDA-100二极管阵列检测器
二极管阵列(PDA)检测器主要用于对蛋白和多肽的检
测。PDA所能提供的关于分析物的纯度和鉴别的信息超
过传统多波长检测器。PDA-100是具有高分辩率低漂
移的高效检测器。它的双光源可提供从190-800nm范
围内的全部波长。使用这种检测器,每个样品的扫描
时间只要几毫秒,光谱的波长、时间、和光度信息是
连续的,增加了单个样品分析的信息量。
通过对分析物谱图和储存在PeakNet6软件中的谱图进
行比较可鉴别分析物。配有双灯的PDA-100检测器可
提供非常低的基线噪声。
色谱工作站PeakNet6
PeakNet6是最有效的色谱数据管理系统。作为色谱工
作站,PeakNet6可为单台仪器提供服务也可同时管理
多台仪器。软件可突出系统优势,具有强大的数据处
理能力、仪器控制能力、安全性以及网络工作能力。
BioLC--测定生物分子的强有力的方法
糖类和糖蛋白的分析
戴安公司的 CarboPac高效阴离子交换柱(HPAE)配
合脉冲安培检测器(PAD)彻底改变了对糖类的测定。
作为测定由各种配糖体(如糖酯、糖肽、低聚糖或氨
基葡萄糖)和其它生物源派生来的糖类的最佳方法,
无需衍生的HPAE-PAD法已得到广泛认可。
BioLC生物液用于可靠地分析糖基化蛋白,制药中的糖
类高聚物以及发酵肉汤中的简单糖类。
系统配
置
GS50梯度泵,PEEK材料,真空脱
气
ED50电化学检测器,检测
池
色谱柱参考戴安公司在生物和制药方面色谱柱应用的
指南
高分离度分析蛋白质和肽
对于离子交换和反相分离来说,BioLC是最优的设计。
非金属流路可耐缓冲液的腐蚀。此外由于BioLC可在典
型的HPLC的压力下工作,使其成为分析肽的极好工
具。
GS50泵可灵活地选择微孔或标准孔流速,这两种流速
均可输送高精度和高重现性的梯度淋洗液。戴安公司
的ProPac柱一次进样即可快速分离小到一个氨基酸的
脱酰胺基变异体,MAbs,以及其它差异蛋白质。
PDA-100是高分辨率和高灵敏度的光谱检测器,可用
于蛋白质和肽的定性和定量分析。
系统配置
GS50梯度泵,PEEK材料,真空脱气
PDA-100光电二极管阵列检测器,PEEK材料检测
池,
AD25光度检测器,PEEK材料检测池,
色谱柱参考戴安公司在生物和制药方面色谱柱应用的
指南
特种核酸的测定
使用戴安独家的DNAPac®柱技术的生物液相BioLC,给
DNA的分离带来了前所未有的高分辨率。应用戴安
MicroBead™技术的DNAPac®柱,可分离碱基数从1-60
的低(聚)核苷酸。可在多种变性条件下,如高温
(80℃以上),Chaotropic 试剂和高PH值(12.4)
条件下,进行对低(聚)核苷酸的筛分完全消除了次级
结构的影响并判定未序列。
系统配
置
GS50梯度泵,PEEK材料,真空脱
气
PDA-100光电二极管阵列检测器,PEEK材料检测
池,
AD25光度检测器,PEEK材料检测池,
色谱柱参考戴安公司在生物和制药方面色谱柱应用的
指南
灵敏的生物小分子的分析
BioLC对复杂基体中的生物小分子的分离和定量有优
势。
诸如有机酸,无机离子,抗生素和维生素类的这些分
析物,均能通过配有光度检测器、电导检测器或安培
检测的BioLC系统,以特定的流速和灵敏度进行测定。
系统配
置
GS50梯度泵,PEEK材料,真空脱
气
ED50电化学检测
器
电导池,
DS3
ASRS-ULTRA(4mm)阴离子自动再生抑制
器
色谱柱参考戴安公司在生物和制药方面色谱柱应用的
指南
不需衍生的氨基酸直接分析
BioLC AAA直接氨基酸分析仪在氨基酸测定方面从配
置上进行了的革新。与现有方法不同,采用高灵敏度
的脉冲安培检测器(IPAD)直接测定的方法,无需柱
前和柱后的衍生,用于测定初级和次级氨基酸,氨基
糖类,含磷氨基酸,以及含硫氨基酸(如磺基丙氨
酸)中的常见氧化产物,检测限可达10-15~10-10摩
尔 ,与茚三酮法相比,灵敏度至少高出50倍。
系统配置
带有真空脱气的微孔PEEK GP50泵
ED50电化学检测器(包括PH参比电极)
氨基酸金工作电极
AAA-DirectTM----不需衍生的氨基酸直接分析技术
技术特点
氨基酸和氨基糖高分辨分离。
阴离子交换分离完全消除了基体影响。
一次进样氨基酸和碳水化合物同时出峰。
灵敏度高,检出限可达pmol, 至少比茚三酮方法高出
50倍。
对于大部分氨基酸, 检测器响应的线性超过三个数量
级。
可靠的定量分析-所测数据与阳离子交换/茚三酮氨基
酸分析方法所测的数据完全吻合。
可以直接地检测尚很难检测的氨基酸,如:色氨酸,
半胱氨酸,胱氨酸,蛋氨酸和磷酸氨基酸。
对于如胶原蛋白之类的复杂蛋白样品来说,是一种更快
速、更便捷的方法。
样品前处理简单。
可以适用于任何常用的水解过程,如6M HCI, 4M甲基
磺酸(MSA),过甲酸氧化/6M HCI,以及4.2M NaOH。
脉冲安培检测器(IPAD)的直接检测,免除了费时的样
品衍生过程及昂贵的试剂消耗.样品只需稀释和过滤,
图1所示为100pmol标样的典型谱图。
最佳保留时间和检测响应值
对氨基酸标准溶液及诸如细胞培养液,发酵液和蛋
白水解液等实际样品的分析已证明了,该系统具有优异
的检测器响应和保留时间稳定性.图2所示是氨基酸标
准混合液连续进样100次以上检测器响应值.图3和图4
分别为细胞培养液介质进样100次以上保留时间和检测
器响应的重现性.
稳定可靠的分析柱技术
AminoPac PA10微孔柱是专门用于氨基酸分离的选择
性高效阴离子交换柱.与以往的离子交换柱相比,这种
柱子有很多优点:
梯度淋洗后快速再平衡。
优异的传质特征,分离效果好。
耐酸碱(PH范围:0-14)
机械稳定性(4000psi)和化学稳定性高,延长柱子寿
命。
复杂基质进样后,可以用常规有机溶剂快速清洗
常用的梯度程序
图5所示为分离22种常见氨基酸的标准三元梯度.
(水,0..25M氢氧化钠,1.0M醋酸钠).如果有特殊应用,
梯度程序可以自由设定.
适用于所有标准水解过程
四种常用的水解过程,如6M HCI, 4M MSA,过甲酸氧
化/6M HCI和4.2M NaOH,都适用于AAA-Direct氨基酸
分析系统.另外,由于色谱保留机理是离子交
换,AminoPac PA10对中性样品组分没有保留,这样就
完全消除了基体的影响.
同时测定氨基酸,氨基糖和碳水化合物
蛋白水解物中通常存在氨基糖。AminoPac PA10对氨
基糖亦有很好的响应,因此在测定氨基酸的同时可测
定氨基糖(图6)。
生化工业中,AAA-Direct氨基酸分析系统已经以实验
和在线方式被用于发酵池和大规模细胞培养液中氨基
酸和氨基糖的直接监控.这就为蛋白和肽治疗过程中氨
基酸和碳水营养物的监控提供了更简便的方法.
图7所示为细胞培养液的分析结果.插图为分析中所用
IPAD的波形,图中蓝线为积分阶段.采用此波形,能同
时测定样品中常见的氨基糖和氨基酸.如果积分阶段移
向更低的电压,羟氨基酸的影响被抑制.同一样品中的
碳水化合物和羟基氨基酸能被选择性地检测.
图8所示是大肠杆菌发酵液随时间变化的一系列谱图的
叠加.各种氨基酸随时间的变化一目了然.这对生产过
程的最优化非常有利,因为基本氨基酸的量可以根据
需要简便地控制和调整.
蛋白质和肽水解产物
运用AAA-Direct氨基酸分析系统,已经成功地分析了
包括胶原蛋白在内的各种蛋白质和肽水解产物.检验数
据与柱后茚三酮分析法的结果完全一致.图9所示为胶
原蛋白水解物的色谱图。尤其值得一提的是,所有氨
基酸的定量只需一次进样。
食品和饮料分析
该系统已经用于多种食品和饮料样品的分析,包括未
加工和加工过的肉类水解物,果汁和蔬菜汁,啤酒和红
酒。
图10所示为多种不同的未加工肉类经过MSA水解后的分
析谱图.图11所示为红酒中的游离氨基酸测定结果。样
品前处理非常简单,因为IPAD的灵敏度非常高,允许样
品稀释1000倍,甚至更高。
图12所示为AAA对胡萝卜汁中的氨基酸和糖的测定结
果,胡萝卜榨汁后经过滤稀释即可直接进样分析
对尚难测定的色氨酸直接分析
色氨酸在常用的HCI水解过程中会分解,影响测定结果.
而NaOH水解过程在柱前、柱后衍生分析方法中又比较
麻烦,因为水解产物必须经中和、稀释。.因此在阳离
子交换/茚三酮方法中势必会消耗大量样品.另外,在衍
生过程中产生的大量NaC1干扰,也是个问题.在AAA-
Direct氨基酸分析系统中,因为用NaOH作为淋洗液,
色氨酸经NaOH后可直接进样分析。样品的准备非常简
单,不需中和反应。进样前只需进行水解产物的稀释
和过滤
图13和14分别表示采用几种不同的水解方法对
大豆粉和牛初乳水解后分析结果的比较,其结果相
近。
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