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PerkinElmer

2022/08/18 17:12

阅读：393

Cell Painting（细胞全景绘制）是一种强大的可用于筛选的高通量多参数图像分析方法，可表征细胞对干扰因素（化合物、药物或基因）的反应。使用具有明确作用机制 (MOA) 的已知参考物对照，筛选未知干扰物。这提供了一个使用机器学习算法对数据进行解析的方式，以降低高通量多参数数据的维度，并识别形态聚类与机制的关系。

至今，细胞全景绘制已被迅速用于表型药物发现和基础研究。然而，具体实施可能会遇到各种挑战，例如细胞模型的选择、合适的标记试剂、如何优化检测仪器和使用合适的数据分析方法，以了解在数据分析过程中生成的数千个特征参数。

在这里，我们为科学家和研究人员提出的相关问题提供答案，以帮助您从细胞全景分析中获得最大收益。

细胞模型

Q：我应该使用什么细胞模型进行细胞全景绘制？

A：几项研究报告了U-2 OS细胞系的使用，该细胞系现在被广泛认为是细胞染色试验的金标准。^{【1,2,3,4,5】}为获得最佳，建议从U-2 OS细胞开始，protocal见Bray et al（2016）。

Q：还有哪些其他细胞模型适用于细胞全景绘制？

A：原则上，大多数贴壁细胞类型都适合细胞涂画，但选择细胞模型的主要考虑因素是生物学问题，以及细胞模型是否适合高内涵成像。一旦工作流程在U-2 OS细胞模型中得到验证，过渡到其他细胞模型更可能会成功。例如，Willis et al.（2020）使用细胞全景绘制测定来表征表型效应，通过使用六种人源细胞系的参考化合物：U-2 OS、MCF7、HepG2、A549、HTB-9和ARPE-19⁶，作者得出结论，针对形态多样的人源细胞系，细胞全景绘制需要优化图像采集和每种细胞类型的机器学习程序，但不需要针对细胞类型进行优化染色步骤。在另一项研究中，Way et al成功地描述了细胞全景绘制应用于CRISPR敲除中的Cas9 A549、ES2和HCC44稳定表达细胞实验⁷ 。最近，Jordi Carreras-Puigvert的研究组应用细胞全景绘制表型方法研究感染COVID-19的MRC-5人肺成纤维细胞⁸ ，此项工作确定了抗病毒化合物能够逆转感染细胞的形态特征，转向非感染状态，并开辟新的抗病毒药物发现途径。

Q：3D细胞模型可以与细胞全景绘制一起使用吗？

A：是的。3D细胞全景绘制的第一个公开证据来自Inventia Life Science Operations Pty Ltd报道 ⁹，他们描述了基于细胞全景绘制表型筛选的工作流程，实验使用到生物打印的U-87MG胶质母细胞瘤3D细胞培养物和Operetta^®CLS™高内涵分析系统。

Q：悬浮细胞可以与细胞全景绘制一起使用吗？

A：悬浮细胞模型：例如外周血淋巴细胞 (PBL) 或Jurkat和HL-60永生化细胞在经典细胞全景绘制中并不常用。原因是此类细胞核大而胞浆小，可供形态空间测量的区域过少。使用改良后的染料和探针解决悬浮细胞模型系统的生物学问题是更可行的选择。

Q：我可以在活细胞成像中使用细胞全景绘制吗？

A：是的。Bray et al. (2016)1报道在细胞全景绘制中使用了一些荧光探针，可用于活细胞成像。活细胞探针的使用中要注意它们的局限性，包括稳定性、细胞毒性和荧光有效时长。许多市售的用于活细胞成像的荧光探针的荧光时效在数小时内到几天。建议加拍明场成像以捕获更多信息。

Q：我可以在细胞全景绘制中使用基因工程细胞吗？

A: 是的。基因工程细胞在细胞全景绘制分析可以减少对生物探针或荧光蛋白标记试剂的需求。注意在这种情况下，您不能使用所有六个PhenoVue™ 细胞染色探针，要避免荧光的发射光谱重叠。此外，基因工程细胞荧光蛋白的另一个优点是能够随着时间的推移测量活细胞动力学测量.

Q：是否有任何细胞模型不适于使用细胞全景绘制？

A：并非所有细胞模型系统都适合HCS成像，例如细胞贴壁不良、细胞聚集体形成、体外生物反应差异等。在测试未验证的细胞模型时，建议使用U-2 OS细胞模型做预实验，测试微孔板表面包被和生物探针浓度对实验的影响。同时要注意，用于细胞全景绘制实验的对照化合物可能不会在所有细胞类型中表现相同。

Q：我可以在细胞全景绘制中使用哪些干扰物？

A：扰动剂是扰动正常的细胞功能、细胞的表型或形态。环境化学毒物、药物、化学品、基因修饰/改造，甚至生长因子都是被认为可以用作细胞研究的干扰物。包括可药用的CRISPR基因组文库、siRNA、mRNA和其他基因敲除、编辑、表达或调节基因。

试剂

你推荐什么微孔板用于细胞全景绘制？

A：实验中微孔板的选择是基于细胞生物学，解决实验设计要求，以及它们是否适合自动化和高通量检测¹⁰。PerkinElmer PhenoPlate™微孔板专为自动细胞成像分析而设计。它们提供出色的平整度和光学清晰度，提供卓越的细胞全景绘制的图像质量和良好的细胞粘附性。PhenoPlate独特的无裙边设计结合Operetta CLS和Opera Phenix^® Plus高内涵成像系统，兼容所有水浸物镜和所有孔位。

你推荐什么染料用于细胞全景绘制？

A：建议研究人员遵循Bray等人在 (2016) ¹ 中的描述购买JUMP consortium.¹¹ PerkinElmer PhenoVue™ 试剂盒套装，两个版本旨在匹配不同的实验条件。对于不同单元模型，您需要重新优化条件和染料浓度。PhenoVue试剂盒已在2D固定细胞模型U-2 OS中验证，如Bray等人所述 (2016)。一些成分，例如PhenoVue Fluor 568-鬼笔环肽，不适合活细胞成像。这是因为它们依赖于细胞内染色结构（例如，肌动蛋白、ER和高尔基体），需要细胞固定和透化，这不与活细胞相容。如果您需要活细胞探针和特定的检测，则有待开发和验证。尽管细胞全景绘制最初是用六个不同的生物探针标记，细胞全景绘制和其他HCS成像分析应设计其它适当的解决生物学问题的生物标志物。使用这种策略，一种或多种试剂在实验中可以替换为其他PhenoVue或BioLegend试剂或类似试剂。例如，用于间接定量蛋白质的一抗与相关二抗可加入实验设计。

有关PhenoVue试剂的更多详细信息，请参见https://www.perkinelmer.com/category/cellular-imaging-reagents。

图像获取

用于细胞全景绘制分析的仪器成像的关键要求是什么？

由于PhenoVue细胞染色试剂包含用六种不同的探针，需要高通量显微镜系统在空间上检测每个探针的荧光强度和表型形态。Opera Phenix Plus是高内涵成像的首选仪器，用于快速捕捉细胞全景绘制图像。Opera Phenix Plus是一种基于激光的高内涵筛选系统，设计有光学滤镜，用于测量宽场和共聚焦模式下六种不同的PhenoVue细胞探针。最新的Operetta CLS高内涵成像系统（HH16000020，2021年10月发布）独特地配备了8个LED，设计有优化的激发和发射光谱，适用于细胞全景绘制。

明场成像可行吗？

是的，Operetta CLS和Opera Phenix Plus系统均可以使用明场投射光成像。

应该使用哪种放大倍率？

放大倍数的选择取决于需要解决的生物问题。不同的放大倍数具有区分不同的形态表型的能力。高内涵成像使用者需要平衡生物分辨率细节和可接受的筛选时间。20倍水镜被推荐作为一个很好的平衡细胞细节和测量时间的常用物镜。

我应该拍摄多少个z平面？

z-planes或z-slice图像是一个选项，Operetta CLS和Opera Phenix Plus系统在荧光和明场通道均可以选择Z平面成像。增加z 切层图像数量，相应地图像采集的时间也会加长。决定何时添加z切层图像采集取决于细胞模型、细胞全景绘制探针在细胞内的空间位置和实验设计问题，比如z轴分辨率决定了使用水浸20x、40x和63x的物镜，最小z切片间隔分别为0.8、0.5和0.5微米。为了挑战复杂的细胞模型系统和3D细胞模型，z切层对于确保图像采集和分析质量至关重要。为了方便图像采集过程中，自动寻找3D细胞模型，我们建议使用 PreciScan™智能采集，可作为Harmony^® 高内涵分析软件的插件使用。

图像分析

Q：什么是HCS特征参数？

A：HCS中的一个特征参数被定义为在像素水平上的一段数字信息，包含图像属性细节。特征参数可以包括感兴趣区域的尺寸、形状，强度、位置和纹理等。在图像分析过程中，生成HCS特征参数取决于实验的复杂性，可以有多达数百到数千个单独的特征参数。

Q：我应该计算多少个细胞以获得可靠可重复的测定结果？

A：这是一个统计学问题，很大程度上取决于每个特征参数的信噪比 (SNR) 的平均值和标准差 (SD)。因为细胞全景绘制试验依赖的是所有特征参数具有未知 SNR、均值和SD的特征，为了获得良好的可靠的统计结果，建议分析超过200个细胞-越多越好。

Q：如何处理细胞自发荧光和伪影？

A：为了减轻HCS中的自发荧光和伪影，有一些策略可以考虑，例如使用图像分析的异常值（即荧光强度高于正常阈值）来区分伪影。此外，众所周知，具有高度代谢的细胞，例如原代肝细胞，自发荧光是固有的，在500nm附近尤为显著。为了帮助克服这个问题，我们建议使用红移探针或淬灭剂，可以帮助减少检测开发过程中的信号。选择试剂时请注意这一点。

Q：细胞全景绘制图像分析时我应该测量哪些特征参数？

A：HCS使用者的反馈表明，核纹理特征是辨别表型差异性的最重要的特征之一。但是，在细胞全景绘制实验中，单个特征不是多变量的分析方法，也忽略了细胞变化的其他细微之处。使用细胞全景绘制试验，有机会测量数十、数百或数千个的参数，不推荐单个特征参数作为靶点，建议采取整体方法, 并使用算法对MOA相似性进行聚类。

Q：在图像分析中，我需要分割所有细胞亚单位吗，尤其是核仁？

A：高级形态特征，如Harmony^®或Signals Image Artist™中的STAR形态软件分析一个分割区域内强度和纹理的分布是如何变化的，核很容易识别分割，因此使用基于STAR方法的功能将描述PhenoVue 512核酸染色在细胞核内的分布是基于强度和质地。因此，分割不需要核仁。

数据分析

二次数据分析有哪些选择？

A：图像分析和参数提取后的二次数据分析是因人而异的，可选择多种统计方法。这些选项包括使用一个简单的Z-Score，用于对HCS特征数据与对照数据相比，对统计相关性进行排序。或采用更全面的方法，充分利用多变量分析方法，例如主成分分析 (PCA) 或t-SNE。微软的excel也具有处理大量HCS特征参数的能力，我们推荐使用珀金埃尔默的Single VitroVivo™平台用于二级分析,直接从原始数据轻松导入，计算多变量HCS数据。

我可以使用多维度数据进行细胞全景绘制分析吗？

A：是的。细胞绘制过程中产生的数据是多维度的，可以通过使用额外的扩充辅助工具，例如人工智能 (AI) 或机器数据分析过程中的学习（ML）。为达成更有效的工作流，降低无效特征数据的维度是关键。

如何在单细胞水平或不同细胞亚群之间为每个小分子

化合物创建形态学参数特征？

A：您可以在单细胞水平创建形态学特征，从而为您解决复杂的亚群识别或药物反应差异的问题，但需要注意的是分析时间增加和大量数据生成。如果您使用的是共培养细胞模型，因为整孔输出数据不能体现疾病模型，所以单细胞或细胞亚群数据输出是极为必要的。在具有异质性的单类细胞体系中，单细胞输出数据也是被常规使用的。

如何决定要使用哪些HCS参数进行 PCA 二级分析？

A：你不需要决定使用哪些参数，算法和统计工具将提供指导。Z-Score排序有助于查找最关键的特征参数，但这可能包括数百到数以千计的参数，决定最重要的单一参数不实用，也不推荐用于细胞全景绘制分析。

使用模型MOA预测，至少需要有多少参数或多少参

数是过量的？

A：工作初期，我们建议拍摄和分析所有可测量的HCS功能参数，可能有数千个，以得出确定结果。然后通过进一步工作去减少特征参数来决定结果的敏感度、可重复性。在实际工作中，大多数研究人员使用100到300个特征参数，但这因实验设计而异。

我可以结合已知MOAs的化合物库，使用细胞全景

绘制来预测新化合物的MOA吗？

A：当然可以，这正是细胞全景绘制的长项。您可以对已知MOAs的标志物进行类似指纹识别的分析，确定可能具有类似靶点的预期MOA。在后续实验中可能产生靶点效应甚至脱靶效应。和所有表型和形态分析一样，后续需要实验来验证。

我可以使用细胞全景绘制方法来预测靶点吗？

A：PhenoVue试剂盒中使用的探针分析细胞的表型形态特征，可用于生物标志物的筛选或二次筛选验证靶点。标准化合物的cell painting实验形成聚类MOAs，可用于预测靶点，但预测靶点后更重要的研究是验证工作。

参考文献

1. Bray M, Singh S, Han H, Davis C, Borgeson B, Hartland C et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 2016;11(9):1757-1774.

2. Gustafsdottir, S. M.; Ljosa, V.; Sokolnicki, K. L.; et al. Multiplex Cytological Profiling Assay to Measure Diverse Cellular States. PLoS ONE, 2013.

3. Nyffeler, J.; Willis, C.; Lougee, R.; et al. Bioactivity Screening of Environmental Chemicals Using Imaging-Based High Throughput Phenotypic Profiling. Toxicol. Appl. Pharmacol, 2020.

4. Bray, M. A.; Gustafsdottir, S. M.; Ljosa, V.; et al. A Dataset of Images and Morphological Profiles of 30,000 Small-Molecule Treatments Using the Cell Painting Assay. Gigascience, 2017.

5. Rohban, M. H.; Singh, S.; Wu, X.; et al. Systematic Morphological Profiling of Human Gene and Allele Function via Cell Painting. Elife, 2017.

6. Clinton Willis, Johanna Nyffeler , and Joshua Harrill. Phenotypic Profiling of Reference Chemicals across Biologically Diverse Cell Types Using the Cell Painting Assay. SLAS Discovery, 2020.

7. Way et al, Predicting cell health phenotypes using image-based morphology profiling. Molecular Biology of the Cell, 2021.

8. Rietdijk, J et al. A phenomics approach for antiviral drug discovery. BMC Biology, 2021.

9. Engel, Martin (2021): Painting in 3D: High throughput phenotypic screening in printed 3D cell culture. figshare. Poster. https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16743820.v1.

10. Auld DS Ph.D., Coassin PA B.S., Coussens NP Ph.D., et al. Microplate Selection and Recommended Practices in High-throughput Screening and Quantitative Biology. 2020 Jun 1. In: Markossian S, Grossman A, Brimacombe K, et al., editors. Assay Guidance Manual [Internet]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004-. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK558077/.

11. JUMP-Cell Painting Consortium [Internet]. Jump-cellpainting. broadinstitute.org. [cited 14 April 2022]. Available from: https://jump-cellpainting.broadinstitute.org/.

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