吸光光度计

李昌厚(中国科学院上海营养与健康研究所 上海 200233)李菁菁（上海中医药大学公共健康学院 上海 201203）摘要：本文根据仪器学理论[3]并结合作者的实践，对紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和最佳光谱带宽的选择方法进行了研究，并对有关问题进行了讨论。本文可供从事紫外可见分光光度计研发、制造、使用和维修的科技工作者参考。0、前言紫外可见分光光度计是目前国际上使用最多的常规分析仪器之一，但如何选择紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（最佳浓度范围）和光谱带宽，很多从事分析工作的科技工作者没有引起重视。对使用者来说，选择紫外可见分光光度计的最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和最佳光谱带宽，是用好紫外可见分光光度计最关键的问题之一，也是一门很深的学问。作者根据仪器学理论和自己的长期实践，对如何选择最佳吸光度范围（或最佳浓度范围）和选择最佳光谱带宽及有关问题进行了研究，提出了选择的方法，并对有关问题进行了讨论。1、吸光度范围（或试样浓度范围）的选择1．1、认真选择最佳吸光度（Absorbance－Abs）范围的重要性[1] 、[2]根据比耳定律[3]，吸光度（Abs）与试样的浓度（C）成正比。所以，不同的浓度范围内测量(即不同的吸光度范围内测量)，会引起不同的误差。这一点，所有使用紫外可见分光光度计的分析工作者，都必须高度重视。有时，很多科技工作者，在工作中往往忽视这个问题，例如：作者曾看到有一位分析人员，用一台光度噪声为0.005Abs的紫外可见分光光度计分析小于吸光度为0.005Abs的样品。她的工作做了很长时间，一是测试结果不稳定，二是结果比标准值小很多，总是得不到可靠的结果。于是，她开始怀疑所用的紫外可见分光光度计仪器有问题，后来，请制造厂的工程师来维修仪器，维修工程师一到现场，稍加检查，就立即指出仪器没有问题。但这位使用者仍坚持仪器有问题，制造厂的工程师经过反复检查，断定仪器肯定没有问题，并指出是样品太稀。后来，对样品稍加浓缩，很快就得到了令人满意的测试结果，所测得的数据，与标准值完全一致。还有一位科研工作者，他使用一台中档偏下的紫外可见分光光度计分析食品中的添加剂，他发现所测得的样品含量总是偏低。后来，也怀疑仪器有问题。结果，经维修工程师检修，认为仪器没有问题。最后，发现被分析的样品浓度太高，被测量样品的吸光度值达到2.5Abs。在把样品稀释到0.8Abs后，再反复多次测量，结果非常准确，与文献值完全一致。这两个例子，充分说明在使用紫外可见分光光度计时，对被分析样品的吸光度范围的选择非常重要。1、2、最佳吸光度范围（或最佳试样浓度）选择的原则1．2、1 吸光度范围不能太小（或试样浓度范围不能太稀）为什么吸光度范围不能太小？因为噪声是主要分析误差的来源之一[2] 、[3] ，它限制被分析试样吸光度值的下限。吸光度太小（或试样太稀）时，有用的信号会被仪器的噪声淹没；当光度噪声大到一定程度或样品吸光度小到一定程度时，吸光度就根本不与样品的浓度成正比。甚至会产生试样浓度变稀时，吸光度值反而增大（噪声所致）的现象，以致无法得到稳定的测量数据，产生很大的分析误差。例如：作者曾用某紫外可见分光光度计测试黄曲霉素，因为仪器的噪声太大，测试数据从0.4Abs就开始超过1％的相对误差。作者的实践表明，一般常规分析时，对大多数试样浓度取10µg/ml～100µg/ml（相当0.3～0,7Abs）左右为最佳。1．2．2、最佳吸光度值范围（或最佳试样浓度范围）不能太大为什么吸光度不能太大？因为杂散光是分析误差的主要来源之一[2]、[3]，它限制被分析试样吸光度值的上限，如果试样的吸光度太大，因为杂散光的原因，可能会使分析误差增大。因为杂散光会使分析测试结果严重偏离比耳定律（分析测试结果的数据可能偏小，也可能偏大；若杂散光被试样吸收则测量数据偏小，若杂散光不被试样吸收则测量数据偏大）。如果仪器的杂散光很大、被分析的试样吸光度值太大，吸光度就根本不与试样的浓度成正比，甚至会产生试样浓度增大时，吸光度值反而减小等反常现象。1．3、 试样浓度的选择原则1．3．1、试样不能太稀（理由如1．2、1所述）1．3．2、试样不能太浓（理由如1．2、2所述）1．3．3、在试样量允许时，试样的浓度应选择靠近最佳吸光度值（0.434Abs）。因为，从理论上讲，比耳定律在吸光度值为最佳值0.434Abs时，分析误差最小 。所以，如果被测试样太浓时，应向靠近0.434Ab的方向稀释。假设被测试试样太浓，达到2Abs左右，这时，应稀释到1Abs以下，但要注意不能太稀。在不同的吸光度上测试，相对误差和绝对误差都不同；作者研究的结果如下：（设仪器给出的△T=0.3%T；目前，国际上的高档紫外可见分光光度计一般都给出△T=0.3%T）。2、最佳光谱带宽的选择[4]、[5]、 [6]2．1、认真选择光谱带宽（Spectrum Band width）的重要性光谱带宽是紫外可见分光光度计主要分析误差的来源。我国广大的分析测试工作者，对紫外可见分光光度计光谱带宽的重要性并没有引起重视。甚至，有的分析工作者，根本就没有认识到光谱带宽会影响分析误差，这是影响我国紫外可见分光光度计仪器和应用水平提高的重要原因之一。作者在长期的实践中深深体会到，光谱带宽是非常重要的技术指标，并对它进行了认真研究[2]、[4]。作者为了研究光谱带宽对分析误差的影响，曾对青霉素钠、青霉素钾进行过测试研究。我国药典规定对青霉素钠、青霉素钾的分析测试用1nm光谱带宽，但作者对同一种浓度的青霉素钠测试用2nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.805Abs；用1nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.825Abs；用0.3nm光谱带宽测试时， 吸光度值为0.865Abs；用0.2nm光谱带宽测试时，吸光度值为0.823Abs。实践证明，0.3nm光谱带宽测试时吸光度值最大，2nm光谱带宽测试的结果比0.3nm光谱带宽测试时吸光度值小0.060 Abs，1nm光谱带宽测试时，吸光度值比0.3nm光谱带宽测试时吸光度值小0.04Abs，说明0.3nm光谱带宽是最佳光谱带宽。2nm光谱带宽测试时的吸光度值和0.3nm光谱带宽测试时的吸光度值绝对误差△A为0.06Abs，相对误差为△A/A＝0.06/0.865=0.69(6.9%)；1nm光谱带宽测试时的吸光度值和0.3nm光谱带宽测试时的吸光度值绝对误差△A为0.040Abs，相对误差为△A/A＝0.046(4.6%)。由此可见，光谱带宽的重要性是不言而喻的。但是，在实际工作中，有许多科技工作者很不重视光谱带宽问题。例如：我国某地的某某制药厂，采用国外某公司的紫外可见分光光度计作为质检仪器，该仪器的光谱带宽为5nm，根本不符合我国和世界各国药典规定用于药品检验的紫外可见分光光度计，其光谱带宽应为2nm的要求。作者从理论上计算，5nm光谱带宽的紫外可见分光光度计，若要用于药品检验，其测试误差为3%，而很多药品检验时，药典规定要求其分析误差在1％以内。所以，使用者一定要高度重视紫外可见分光光度计的光谱带宽的选择。2．2、光谱带宽选择的原则[2]2．2．1、根据分析工作的误差要求选择光谱带宽因为不同的光谱带宽对同一种药品进行分析测试有不同的误差，所以，不同行业应对光谱带宽有不同的要求。使用者应根据分析工作的误差要求来选取不同的光谱带宽。特别是制药行业、科研工作或要求较高的使用者，更应如此。2．2．2、光谱带宽不能过大或过小的原因我们应根据被分析样品对误差的要求，选用不同的光谱带宽来进行分析测试。一般来讲，不同的试样要求用不同的光谱带宽来分析，并且，我们应该选择最佳光谱带宽或选择靠近最佳光谱带宽的光谱带宽来分析，才能得到最佳分析结果。有些科研工作者以为光谱带宽越小越好（分辨率高），也有科研工作者以为光谱带宽越大越好（能量大，灵敏度高）。其实不然，如前所述，作者对同一浓度的青霉素钠、青霉素钾的测试就很好的说明了问题。2．3、光谱带宽与分析误差的关系在理想状态下[7]、 [8]，光谱带宽与分析误差的关系如表2：表2 在理想条件下，A obs与SBW在吸收极大时的关系[4]RBWA obs/ARBWA obs/ARBWA obs/A0.01000.99950.06000.99830.20000.98190.02000.99950.07000.99770.30000.96040.03000.99950.08000.99700.40000.93210.04000.0.99920.09000.99620.50000.89870.05000.99880.10000.9954表2中：RBW 为相对带宽；RBW＝SBW/NBW；NBW为被测样品的吸收带半宽度，指样品的吸收值达到最高峰值之半的两点间的波长间隔；A obs为吸光度实际测量值；A为吸光度理论值。表2 可供分析工作者用来修正实验值，但只适用于吸光度实际测量值小于1.0时的情况。因为一般的常规分析中，被测样品的实际测量吸光度值基本上都小于1.0，所以，表2具有实际参考价值。有学者对光谱带宽与分析测试误差的关系进行过研究，如Owen[5] 研究后指出：当仪器的光谱带宽（SBW）与被测样品的自然带宽（NBW，即吸收带半宽度，一般为20nm）之比小于或等于1时（即SBW/NBW≦0.1时），该光谱仪器可满足99％的样品的分析测试工作，且分析测试的准确度在99.5%以上。这也是我国和世界各国药典规定用于药检的紫外可见分光光度计的光谱带宽要求≦2nm的原因。曾有文献[6] 报道过光谱带宽对分析测试误差的影响，此不赘述。作者研究过光谱带宽对青霉素钠、青霉素钾定量分析的影响，发现青霉素钠定量分析的最佳光谱带宽与药典规定不一致（药典规定:取本品加水制成1ml含1.80mg的溶液，… … ，用1nm光谱带宽、在264nm处测试，吸光度应为0.80-0.88）。笔者在药典规定的条件下，将光谱带宽从1nm开始减小，一直减到0.3nm,其峰高一直在增高！但低于0.3nm时，峰高就开始下降。这说明青霉素钠的最佳光谱带宽是0.3nm，而不是1nm。为此，作者向当时国家药典委员会的专家张淑良先生（上海药检所）反映，他们接收了此意见。所以，今天的药典委员会已经去掉了每一种药品，一定要采用多大的光谱带宽检测了。笔者根据表2计算：当SBW为2nm以下时，由于SBW引起的分析测试的相对误差小于0.5%；但是，当SBW为5nm时，分析测试的相对误差将达到2.7%。可惜，我国有很多分析工作者不注重这个问题，有些药厂用SBW为5nm的UVS来作质量控制，其仪器本身的误差就远远超过我国药典规定的1％的要求，这必须要引起我国广大药检工作者重视。3、讨论3．1目前，国内外很多科技工作者经常将光谱带宽和狭缝宽度混为一谈,很多仪器制造商经常在自己的说明书中说：“狭缝宽度为XXXnm”，这是不对的。因为在光谱仪器中，狭缝宽度以mm计，而光谱带宽以nm计,二者相差一百万倍（106）。所以只能说“光谱带宽为XXXnm”，而不能说“狭缝宽度为XXXnm”。同时还必须注意，光谱仪器的狭缝宽度制造商一般是不会告诉使用者的，因为它涉及到仪器设计时所选用的准直镜焦距、光栅和物镜的焦距等指标。所以，我们对仪器的技术指标描述应该注意科学性、国际接轨和规范性。3．2 有许多紫外可见分光光度计使用者，很不注重对吸光度范围的选择,他们不了解不同浓度（或吸光度）分析时，有不同的分析误差。因此，往往在样品前处理上有时比较马虎,。他们此外，也不大注意或不懂得将样品稀释到最佳浓度范围,这是很多使用紫外可见分光光度计的分析工作者应该特别引起重视的问题。3．3目前，国外有些紫外可见分光光度计制造商,在自己的说明书中写某某最高级的紫外可见分光光度计，仪器的最大光谱带宽为8nm（特别是在招标时，作为仪器的“特点”提出)，这完全在误导使用者。因为，从文献[2]可以非常简单计算出，光谱带宽为8nm时，分析测试结果的相对误差达到了6.79%。而紫外吸收光谱分析是一种精密分析，有些样品（如药品）分析时，要求相对误差小于1%。例如：世界上许多国家的药典规定，用于药品检验的紫外仪器，要求的光谱带宽为2nm，此时的相对误差只有0.5%。所以，在高档（或最高级）的紫外可见光分光光度计中，写出光谱带宽为8nm是不合适的。4、主要参考文献[1]陈国珍主编，紫外可见光分光光度法，原子能出版社（北京），1983.[2]李昌厚著，紫外可见分光光度计，北京：化学工业出版社，2005[3]李昌厚著，仪器学理论与实践，北京：科学出版社，2008[4]李昌厚，光谱带宽对分析误差影响的研究，分析测试技术与仪器，，10(2)，65～67，2004[5]T. Owen, Fundamentals of UV-Visible Spectroscopy,© Copyright Hewlett-Packard Company, Printed in Germany 09/96，Hewlett-Packard publication number 12-5965-5123E[6]E.disbury, J. R. Practical Hints on Absorption Spectrometry,UV/Visible,NewYork, Plenum Press,1967作者简介李昌厚，中国科学院上海营养与健康研究所研究员、教授、博士生导师、国务院政府津贴终身享受者；原仪器分析室主任、生命科学仪器及其应用研究室主任；曾任华东理工大学等兼职教授、上海化工研究院院士专家工作站专家委员会成员、中国仪器仪表学会理事、中国仪器仪表学会分析仪器分会第五届和第六届副理事长、全国光谱仪器专业委员会副主任、全国高速分析专业委员会副主任、原国家认监委实验室计量认证/审查认可国家级常任评审员、《生命科学仪器》副主编、《光谱仪器与分析》副主编、国家科技部多项重大仪器及其应用专项的专家组组长等职。主要从事各类光谱和色谱仪器及其应用研究；在仪器学理论、分析仪器性能指标的测试方法、光电技术等方面有精深研究；以第一完成者身份，完成了15项科研成果，其中5项获得省部级以上科技奖励（含国家发明奖1项）；发表论文280篇（退休后97篇）、出版了：仪器学理论与实践、光谱仪器及其应用、色谱仪器及其应用等的专著5本。曾先后任北京普析、美国ISCO等国内外十多家高科技公司的专家组、顾问组组长、《仪器信息网》、等多个高科技学术团体的技术专家顾问或专家委员会成员等学术团体的领导职务。

UV-2700配有低杂散光衍射光栅，是一种能实现超宽测光范围的分光光度计。它可以很容易的测量传统仪器很难测定的高吸光度的样品。它是测量不可被切薄的、稀释的或不能进行预处理的样品的理想选择。下面我们向您介绍使用UV-2700测量高吸光度样品的实例。 仪器概述 UV-2700配备了岛津专利的低杂散光衍射光栅Lo-Ray-Ligh® 使杂散光降到了极低的水平。Fig.1展示了Lo-Ray-Ligh® 低杂散光衍射光栅。这种衍射光栅拓展了光度计的使用范围，使吸光度到达了8（透光率0.000001%），这是现有的仪器不能达到的，它使测量精度上了一个新量级。 此外，UV2700的另一大特点就是造型简洁、节省空间。如此高性能的仪器尺寸仅为450mm长× 600mm宽× 250mm高。Fig.2是产品的外观展示。 测量高锰酸钾水溶液 我们准备了8个不同浓度（65mg/L-520mg/L）最大吸光度近似为1-8的高锰酸钾（KMnO4）溶液，然后测定以检验在高吸光度范围内的光谱图及校准曲线线性。光谱图如Fig.3所示，测定条件如Table 1所示。测定后，我们得到了在极高的吸光度范围内无明显噪音的质量极好的光谱图。 如Fig.4所示，由最大吸光度在525nm附近的光谱图得到校准曲线。校准曲线清晰的显示出了直到高吸光度区域的极好的线性。 偏振膜的测量 偏振膜是被广泛应用于液晶显示器和太阳镜等物品中的一种材质。自然光传输光波的电场在不同的方向上振动，但是这种膜由一种只允许光波在单一的平面路径上振动通过的材质构成。偏振膜特性是基于其屏蔽性和透射性来评估的。 Fig.5展示了测量偏振的旋转膜支架。两片偏振膜被置于薄膜支架上，其中一片偏振膜在平面上旋转。首先，如Fig.6A所示，测量首先使膜传输装置在轴向方向上彼此成直角（crossed Nicols）以达到最好的屏蔽水平，此时，透射比为最低值。接下来，一个偏振膜旋转90度，使传输装置在轴向方向上平行（parallel Nicols）以达到极好的透光效果。 Fig.7显示了偏振膜测量的结果。测量时使用的参数请见Table 2。甚至在极高的屏蔽区域内，在crossed Nicols条件下吸光度5的范围内仍可获得很好的光谱图。 结论 使用杂散光水平极低的UV2700，可以测量极高吸光度的样品。因此，它是测量那些吸光度高且不能被切薄、稀释或不能进行预处理的样品的理想选择，如在文中用于偏振膜的分析。 关于岛津 岛津企业管理（中国）有限公司是（株）岛津制作所为扩大中国事业的规模，于1999年100%出资，在中国设立的现地法人公司。 目前，岛津企业管理（中国）有限公司在中国全境拥有12个分公司，事业规模正在不断扩大。其下设有北京、上海、广州分析中心；覆盖全国30个省的销售代理商网络；60多个技术服务站，构筑起为广大用户提供良好服务的完整体系。 岛津作为全球化的生产基地，已构筑起了不仅面向中国客户，同时也面向全世界的产品生产、供应体系，并力图构建起一个符合中国市场要求的产品生产体制。 以&ldquo 为了人类和地球的健康&rdquo 为目标，岛津人将始终致力于为用户提供更加先进的产品和更加满意的服务。 更多信息请关注岛津公司网站www.shimadzu.com.cn。

紫外可见分光光度计是一种应用很广的分析仪器。它的应用领域涉及制药、医疗卫生、化学化工、环保、地质、机械、冶金、石油、食品、生物、材料、计量科学、农业、林业、渔业等领域中的科研、教学等各个方面，用来进行定性分析、纯度检查、结构分析、络合物组成及稳定常数的测定、反应动力学研究等。因为仪器涉及到光学、电学和结构等，所以它需要在一定的环境中应用（1）定量分析根据琅伯-比尔定律，样品的浓度和吸光度是成正比关系的，浓度越大，吸收值越高，所以分光光度计用的zui多的还是定量分析，定量分析的种类有很多，这里介绍常用的几种定量分析方法：A、法：法是紫外可见分光光度计诸多分析方法中使用zui多的一种方法。这是一种以琅伯-比尔定律A=εbC为基础的分析方法，某一物质在一定波长下ε值是一个常数，石英比色皿的光程是已知的，也是一个常数。因此，可用紫外可见分光光度计在λmax波长处，测定样品溶液的吸光度值A。然后，根据琅伯比尔定律求出C=A/εb，则可求出该样品溶液的含量或浓度。B、标准法：在选定的波长处，在相同的测试条件下，分别测试标准样品溶液C标和被测试样品溶液C样的吸光度A标和A样。然后，按下式求得样品溶液的浓度或含量。C样=A样/A标×C标C、标准曲线法紫外可见分光光度计zui常用的定量分析方法是标准曲线法。即先用标准物质配制一定浓度的溶液，再将该溶液配制成一系列的标准溶液。在一定波长下，测试每个标准溶液的吸光度，以吸光度值为纵坐标，标准溶液对应得浓度为横坐标，绘制标准曲线。zui后，将样品溶液按标准曲线绘制程序测得吸光度值，在标准曲线上查出样品溶液对应的浓度或含量。A、其它分析方法除上述几个分析方法外经常使用的分析方法外，还有比吸收系数法、zui小二乘法、解联立方程法和示差分光光度法。（2） 定性分析如果未知物的紫外吸收光谱的zui大吸收峰波长λmax、zui小吸收峰波长λmin、zui大摩尔吸光系数εmax，以及吸收峰的数目、位置、拐点与标准光谱数据完全一致，就可以认为是同一种化合物。定性分析的主要目的是知道分析样品中是什么物质。定量分析和定性分析是分光光度计的两大主要功能，特别是定量分析。其它的分析都应该是从这两大种功能中发展出来的。