弓形虫检测

刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种能在细胞内寄生生活的寄生虫，它能够感染包括人在内的几乎所有温血动物，引发弓形虫病。处于速殖子阶段的弓形虫在宿主细胞内进行无性繁殖，即：母体细胞的细胞核附近产生两个子代弓形虫，后者会逐渐发育为成熟的速殖子，而母体细胞的结构随之消失。弓形虫速殖子具有表皮下微管（SPMTs）和类锥体（conoid）等骨架结构，在维持细胞形态、运动和侵染宿主过程中发挥重要作用。先前的相关研究主要聚焦于弓形虫成熟速殖子及其骨架结构，描述了细胞骨架在成熟速殖子中的分布情况，并通过冷冻电镜分别解析了表皮下微管和类锥体纤维的精细结构，揭示了表皮下微管是由13根原丝组成的“句号”形状；而类锥体纤维是由9根原丝组成的“逗号”形状 (Sun et al., 2022)。而对弓形虫速殖子增殖过程的结构研究目前仍以荧光显微技术为主要手段，缺少更高分辨率的结构。该增殖过程区别于常见的细胞“一分为二”的有丝分裂方式，存在大量未知的细节值得去探索。2023年2月25日，北京大学生命科学学院郭强课题组在Advanced Science发表了题为“Cryo-Electron Tomography of Toxoplasma gondii Indicates That the Conoid Fiber May Be Derived from Microtubules”的研究论文。该工作首次将冷冻电子断层成像技术应用于探究弓形虫速殖子的增殖过程，在纳米尺度下详细描述了子代弓形虫的三维原位结构，并在结构方面提供了类锥体可能起源自微管的证据。该研究利用了冷冻电子断层成像（cryo-ET）并结合了聚焦离子束（FIB）技术，获得了成熟速殖子及其细胞核附近新生的子代弓形虫的原位结构。作者分别展示了纳米尺度下的成熟和子代速殖子顶部复合物的三维结构（图1 B和H），重点描述了细胞骨架相关结构的细节，发现子代速殖子在早期就已经具备完整的细胞骨架结构，印证了荧光显微技术的研究结果。通过对比，作者发现成熟与新生速殖子的细胞骨架在空间分布上存在差异，猜测这可能与子代速殖子发育过程中所处的环境与成熟速殖子不同有关。让人意外的是，研究者发现子代速殖子的类锥体纤维中同时存在“句号”形状和“逗号”形状这两种结构。这两种形状能够同时出现在同一根类锥体纤维上（图1 C），并且存在一段约10 nm长、由“句号”形状向“逗号”形状过渡的区域。进一步计算表明“句号”形状的类锥体纤维由13根原丝组成（图1 C），与微管一致；基于两者在结构上的相似性，且两者都主要由tubulin蛋白组成，推测类锥体纤维可能起始于微管，其在成熟过程中失去4根原丝，并逐渐转变为最终的“逗号”形状（图1 I）。该研究有助于我们更深入地理解类锥体的组装，以及弓形虫增殖时子细胞从产生到逐渐成熟的过程，为进一步探寻弓形虫及其他顶复门寄生虫控制药物提供支持。图1 （A-C）来自弓形虫子代速殖子，（G-I）来自成熟速殖子。（A-B和G-H）为类锥体附近区域的结构。（C和I）为类锥体纤维不同位置的横截面。北京大学生命科学学院、生命科学联合中心郭强研究员为该研究的通讯作者。课题组20级PTN项目博士研究生李智勋为该研究的第一作者，课题组技术员杜文静，以及中山大学伦照荣教授，赖德华副教授和杨炅同学为该工作做出了重要贡献。该工作中冷冻电镜样品制备和数据采集在北京大学冷冻电镜平台完成。数据处理获得了北京大学未名超算平台的硬件和技术支持。北京大学国家蛋白质科学中心的工作人员提供了技术支持。该研究得到了北京大学生命科学中心（CLS）、生命科学学院（SLS）、SLS-启东创新基金以及昌平实验室的经费支持。参考文献：Sun, S.Y., Segev-Zarko, L.-a., Chen, M., Pintilie, G.D., Schmid, M.F., Ludtke, S.J., Boothroyd, J.C., and Chiu, W. (2022). Cryo-ET of Toxoplasma parasites gives subnanometer insight into tubulin-based structures. Proceedings of the National Academy of Sciences 119, e2111661119.研究组介绍郭强：北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心，研究员、博士生导师。实验室研究领域：我们是原位结构生物学实验室。关注“细胞建筑学”：各个亚细胞结构是如何搭建成一个具有完整生物学功能的细胞，以及“生物大分子社会学”：细胞内的细胞器、生物大分子之间的相互关系。原位结构生物学是基于冷冻光电联用（CLEM）、冷冻电子断层扫描（cryo-ET）等技术的新兴结构生物学分支，是一种可以在细胞生理状态下，对生物大分子和亚细胞结构在分子分辨率（1 ~ 10 nm）水平进行原位的结构分析和功能研究的技术手段。我们主要研究方向包括：1. 在纳米、亚纳米尺度对基础细胞生物学问题的研究。2. 对包括神经退行性疾病在内的老龄化疾病致病机制的研究。3. 适用于组织样品的高分辨原位结构生物学方法优化。

近日，中国农业科学院上海兽医研究所联合上海市动物疫病预防控制中心，成功建立宠物(犬猫)狂犬病、结核病、弓形虫病、附红细胞体病和钩端螺旋体病人畜共患病检测技术方法。据悉，新发现的人类传染病大约3/4属于人畜共患病，预防和控制人畜共患病成为全人类关心的话题，与经典方法比对，上海成功建立的5种人畜共患病检测法简便快速、灵敏度高、特异性强 研制出弓形虫快速诊断试剂盒 完成新兽药申请书1项 申报国家专利2项，并进行了上海市犬猫人畜共患病流行病学调查。　　狂犬病　　狂犬病毒可以感染所有温血动物，宠物和人一旦感染发病，几乎无一幸免，控制该病的重中之重是预防。为了评价疫苗的免疫保护效力，科研人员创新思维，国际首次利用PCR方法建立了检测动物血清样品中和抗体水平ELISA方法，与法国Synbiotics公司ELISA试剂盒符合率为96%。该方法操作简便，适合大量血清样本的检测，克服了传统血清学方法存在操作繁琐、试验周期长、使用活毒、存在散毒危险等缺点，将为狂犬病病毒中和抗体的监测提供可靠的检测工具。　　弓形虫病　　弓形虫病对人畜的危害很大，导致孕妇早产、流产、胎儿发育畸形，是免疫功能低下患者(如爱滋病病人)的主要死亡原因之一。课题组建立一套弓形虫Nested-PCRRFLP检测技术，既能大幅度提高灵敏度，又能区分弓形虫、新孢子虫 制备了弓形虫病快速诊断试剂，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、快速简便、无须仪器设备等优点，在基层现场弓形虫病诊断、流行病学调查研究中显示出卓越的性能优势。　　结核病　　结核病是单病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，全球已感染结核菌人数约20亿人，我国患结核病的人数居全世界第2位，受感染人数超过4亿人。课题组建立犬猫结核杆菌的荧光定量PCR检测技术，敏感性好、特异性强，与结核分枝杆菌的固体培养方法(“金标准”)符合率达95%以上，该方法显著缩短了结核病确诊时间，将为犬猫结核病的普查工作提供便捷手段。

由于不同国家和地区对食品安全测试的需求，全球食品检测市场正在增长。据国外一份市场调研报告显示，2013-2018年全球食品检测市场有望以6%的速度增长，即从2013年的34.5亿美元增长至2018年46.3亿美元。　　该市场调研报告称，来自于当地实验室测试仪器公司和仪器OEM厂商的竞争是这一市场的最大竞争。其中特别提到了中国的仪器制造商，包括普析通用、聚光科技、北分瑞利、上海天美将在实验室分析仪器市场，对安捷伦、岛津、珀金埃尔默和赛默飞世尔构成挑战。　　检测仪器和实验室服务主流供应商的核心增长战略是以低成本的分析仪器进行市场渗透，并通过投资新建实验室进行积极扩张。　　微生物学分析拥有巨大的收入份额和增长潜力，未来五年将成为主要的产品销售市场。其中，病原体市场主要是指对诺如病毒、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌、弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耶尔森氏菌、弓形虫、弧菌属和李斯特菌的检测。其他细分市场是过敏原分析、掺假和转基因生物检测、脂肪和油的分析。　　公众关注度的提升、全球食品供应商的产品召回事件、政府法规和严格政策的增加也是刺激因素。　　目前，全球第三方检测公司如SGS、Eurofins将其战略目标市场定位在了中国、印度等国家，以增加他们的市场份额和收入。这些跨国公司将会建立检测实验室，以满足当地政府设立安全标准和要求的需求。（编译：刘玉兰）