氢氧化铵

目的为证实在进行四个以上数量级进行定量时, LC/MS/MS的样品残留量可降低至可测得的水平以下。背景现今质谱仪的灵敏度已经能够实现跨五个数量级的检测，且柱上进样量的定量下限可低至阿克级。要使高性能质谱仪的灵敏度不断增加，也要求LC系统上的样品交叉污染达到最低，以优化分析性能。有关验证跨多个数量级的生物分析方法的规范通常要求最高浓度校准品的样品残留量不多于最低浓度校准品的20%。1因此，为使校准范围跨四个数量级，必须使样品残留量低至0.002%以下。若校准范围在四个数量级以上，则必须使交叉污染减少至更低的水平。通常，随着对柱上进样量交叉污染的要求不断严格，系统污染变得非常关键。LC系统及方法必须能够重复地将分析物自进样器、管道及色谱柱上去除，以使每次进样都没有交叉污染。在对奥美拉唑进行分析时，Xevo TQ-S上的ACQUITY UPLC I-Class系统可使样品残留量减少至0.0005%以下，且其线性定量范围跨度可达四个数量级以上。解决方案Xevo TQ-S是具有高灵敏度的用于LC/MS/MS分析的质谱仪。它需要一个能够解决交叉污染问题的UPLC 入口，以与该仪器宽泛的线性动态范围相匹配。ACQUITY UPLC I-Class系统可选用两种样品管理器：固定定量环(SM-FL)或流通针式(SM-FTN)进样器，这两者在设计上均能实现良好的抗交叉污染性能。在分析奥美拉唑时，采用SM-FTN设计。该种类型的进样器，在分析过程中，以移动相(梯度)冲洗针头内部。在进样口，FTN采用单种溶剂清洗针头外部，且在设计上能够实现防止清洗溶液与样品或流动相接触。在密封面同时清洗针头以及密封垫可减少污染几率。清洗程序已编入本方法中，且可设置为在进样之前以及进样之后清洗。清洗溶剂的组成取决于样品，且其必须能够很容易地溶解分析物。对于pKa为8.8的奥美拉唑来说，可采用含有氢氧化铵的清洗溶剂来清洗注射器。此外，当将氢氧化铵用于流动相时，系统的交叉污染将更低。在碱性条件下，可使奥美拉唑的离子化效率进一步提高。为评估交叉污染，向色谱柱注射具最高浓度(10 ng/mL或10 pg)的标准品。如图1所示，在注射最高浓度标准品之后首次进行空白注射时，未观察到有交叉污染。基于校准曲线，确定样品残留量低于0.0005%，而这低于质谱的检测下限。如图2所示，在500 ag至10 pg范围内，采用1/x权重系数，可获得相关系数为0.99997的线性，这足以证实可在与Xevo TQ-S连用的ACQUITY UPLC I-Class系统上对奥美拉唑进行线性校准。小结ACQUITY UPLC I-Class系统非常适用于需要跨四个以上数量级进行定量的高灵敏度LC/MS/MS方法的交叉污染要求。在对奥美拉唑进行分析时，在Xevo TQ-S上未检测到样品残留，且由此可知，样品残留量已减少至0.0005%以下。由于样品残留量很少，可在500 fg/mL至10 ng/mL或500 ag至10 pg之间进行校准。参考文献1. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm070107.pdf

zui近月旭科技除了产品以外，我们发布的内容也越来越受到大家的喜爱，遭到了多家公众号的自主发布，热度也颇高，我们十分“欣慰”。我们的内容能够得到大家的喜欢，真的是我们zui高兴的事情。但是其发表的内容因为水印等问题，谱图截取并不完整，影响大家的观看体验。所以小编就来以正视听，将完整的谱图，以及zui完整的杂质分离方法开发过程分享给大家，我们一起变得更强！首先来看看需要分离的三个物质的结构式：01 分析目的要求开发一种合适的分析方法，使上述3种化合物在浓度1.0mg/mL的情况下分离度大于1.50。开始方法开发之前，di一件该做的事是什么呢？当然是去了解这几个物质的性质，尽可能的得到有关这些物质的信息，这样可以为后面工作节省zui多的时间。而对这三个物质得到的信息大致如下：三种物质极性比较强，水溶性比较好，在常规C18色谱柱保留太弱，基本上与溶剂峰重叠。结构式上主要是官能团的差异，分别为-NH2，-Br，-COOH，差异性很大。综合考虑，有两种方案：一是加离子对试剂，用反相C18色谱柱增强保留，进行分离；二是使用离子交换色谱柱进行分离。首先由于个人的习惯，离子交换色谱被我直接排除（离子色谱平衡比较慢，而且离子交换色谱柱非常容易出现重现性问题）。所以本实验采用C18添加离子对试剂的方法。考虑的实验过程中需要使用离子对试剂，且流动相pH需要大范围调整（可能用到碱性流动相），所以色谱柱选择月旭Xtimate C18（4.6×250mm，5μm）色谱柱，流速：1.0mL/min，柱温30℃，检测波长220nm。02 流动相优化及测试结果图谱2.1 初步尝试流动相：0.05mol/L庚烷磺酸钠+0.05mol/L磷酸二氢钾，PH=4.60。结果：化合物3保留时间2.6min，化合物1不出峰。估计是化合物1保留太强未洗脱下来。接下来，调整pH并增加有机相的比例，来加大洗脱能力。2.2 流动相：缓冲液（1.00g辛烷磺酸钠，10mM磷酸二氢钾至500mL水中，用磷酸调pH=2.30）：甲醇=60：40。混合对照图谱如下：实验中将庚烷磺酸钠改为辛烷磺酸钠，增加有机相（甲醇）比例，结果三个物质分离良好，但是化合物1（19.9分钟）峰型太差，下一步优化化合物1的峰型。2.3 流动相：缓冲液（1.00g辛烷磺酸钠，10mM磷酸二氢钾至500mL水中，用磷酸调pH=2.30）：乙腈=80：20。化合物1图谱：基于上一次实验，将有机相甲醇变为乙腈，通过改变选择性看是否峰型会有改善。结果发现并没有任何改善，而且发现这个方法中有机相只提供洗脱能力，不提供选择性改变作用。2.4 流动相：缓冲液（缓冲液：1.00g十二烷基磺酸钠，50mM氯化铵至500mL水，用磷酸调pH=1.80）：甲醇=60：40。混合对照图谱：当时换成这个流动相的主要思路是，加十二烷基磺酸钠使保留更强，加氯化铵提高离子浓度，调pH至1.80强酸性使化合物1中-NH2官能团作用更弱，达到优化峰型的目的，但是效果很差。回头总结发现我们所有的目光都聚焦在三种物质的不同官能团上，导致越走越偏离分离的轨迹，这里，三个物质共同含有的官能团可能也是影响分离的主要因素，换了个角度后，豁然开朗了。推翻了之前的方案，将离子对试剂换为四丁基氢氧化铵，从头开始。2.5 流动相：缓冲液（4mL 10%四丁基氢氧化铵水溶液，1.36g磷酸二氢钾至500mL水中，用三乙胺调pH=9.30）：乙腈=80：20。混合对照图谱：流动相中添加三乙胺和并将pH调成9.3目的是抑制化合物1的拖尾，但是结果发现三种物质没有分开。继续优化条件将pH值降低。2.6 流动相：缓冲液（4mL 10%四丁基氢氧化铵水溶液，1.36g磷酸二氢钾至500mL水中，用三乙胺调pH=7.00）：乙腈=80：20。混合对照图谱：看到这结果是不是项目就OK了。但是既然是方法开发，方法重现性实验实验是必不可少的，需要用一根新色谱柱重现该色谱条件。结果问题就来了.....化合物1图谱：化合物1峰型一直分叉，zui终发现应该是色谱柱使用多种离子对试剂，造成色谱柱改性，新色谱柱不能重现结果。好吧，再开始。然后又是继续摸索。不得不说有时候运气也是成功的一部分，在一次流动相配置过程中，看到四丁基氢氧化铵试剂旁边还有一瓶四丁基溴化铵，突然我就冒出想法，用四丁基溴化铵试试，不知道结果会怎么样，说做就做。2.7 流动相：缓冲液（1.00g四丁基溴化铵，1.36g磷酸二氢钾，1.0mL三乙胺至500mL高纯水。用磷酸调节pH=7.10）：乙腈=80：20。混合对照图谱：03 结果结果：分离度，峰型都满足要求，完美。当然还是需要重现方法的。三根新色谱柱重现结果：zui终色谱条件：色谱柱：月旭Xtimate C18（4.6*250mm，5μm）。流动相：缓冲液（1.00g四丁基溴化铵，1.36g磷酸二氢钾，1.0mL三乙胺至500mL高纯水。用磷酸调节pH=7.10）：乙腈=80：20检测波长：220nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样体积：10μL。搞定交差！04 实验小结在液相应用方法开发过程中，首先需结合需要分离的目的，确定思路，一个方法zui初的思路，是决定这个方法开发的效果，效率的zui根本因素；其次是细节，任何细节都有可能导致你实验的成功与否；zui后是运气，牛顿发现万有引力还有运气成分呢，说不定你是下一个。同时，在一个方法确定好之后，一定需要使用一根新的色谱柱来验证，因为在方法开发过程中，我们会使用到各种流动相条件，会对色谱柱一个改性，特别是使用离子对试剂的方法，否则后续的重现性问题会是一个非常头痛的事情。

鬼峰是液相色谱分析中常见问题之一，由于鬼峰来源很多，想要去除它是很难的事情，2018年色谱先生品牌推出Ghost Sniper Column，能有效去除常规流动相和泵中带来的鬼峰，然而含离子对流动相中鬼峰无法去除；通过一年多研究，2019年12月，我们将重磅推出阳离子对鬼峰捕集柱，为Ghost Sniper Column捕集柱系列增加一名新成员。 该阳离子鬼峰捕集柱不仅可以捕集常规流动相中的鬼峰，亦可捕集含阳离子对流动相中的鬼峰，从而降低不明因素对分析方法的干扰，提高分析结果的准确性。从图1 中可以看出该鬼峰捕集柱可适用于我们绝大多数常用的流动相体系。 实测案例：洗脱条件：流动相A：四甲基氢氧化铵溶液（取10%四甲基氢氧化铵溶液100ml，加水900ml，用磷酸调节pH至5.0）-乙腈（85:15）流动相B：乙腈流速：1.0ml/min检测波长：210nm时间038131420A%958240409595B%518606055 使用上述色谱条件，对空白与样品进行了安装与不安装阳离子对鬼峰捕集柱的对照测试。 实验结果：从上述4张图可以看出，阳离子对鬼峰捕集柱可以完美去除含阳离子对流动相中鬼峰。 从12月16日起，我们将正式开始发售阳离子对鬼峰捕集柱，欢迎新老客户前来咨询。