智能蛋白质多维纯化系统

p /pp　　层析纯化技术由于其高选择性、灵活性、易放大性等优点，已经成为蛋白质药物纯化中不可或缺的技术。传统的层析填料为多糖基质，孔径一般在100 nm以下。1970年代出现了大孔和微孔无机材料硅填料，虽然增大了孔道、提高了层析的分辨率和流速，但只能在PH2-7.5范围内稳定，不利于分离纯化在碱性范围内稳定的蛋白质或是需要碱性层析条件的分离，从而限制了其在大规模快速分离蛋白质层析上的应用。多孔聚合物微球由于其高的比表面积、高的机械强度和多样的表面特征，常被用作层析分离纯化的填料。目前已发展出了多种表面基团、基质种类的层析填料，成功用于疫苗、病毒、抗体、酶、细胞因子等的分离纯化。/pp　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　层析纯化病毒、病毒样颗粒等生物大分子的瓶颈问题/strong/span/pp　　随着病毒、病毒样颗粒在疫苗、肿瘤治疗、免疫治疗中的地位越来越重要，这类复杂生物大分子的分离纯化需求也逐渐增加。然而传统填料由于孔径较小，蛋白质只能以扩散方式通过填料，传质速率慢，处理量低，造成分离时间长、容易失活等问题[1]。当蛋白质体积较大时，填料表面在吸附一层蛋白后，由于体积位阻以及静电排斥作用，会阻碍其它的蛋白质进一步进入孔内，造成填料的载量下降。另一个限制是病毒或疫苗，尤其是带有包膜的病毒或疫苗，在狭窄的填料孔径内发生吸附时非常容易发生结构变化，破坏其整体结构。在乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的纯化中发现这种病毒样颗粒在层析时会发生解聚[2]，经过离子交换层析分离后，疫苗的回收率通常不到50%[3, 4]。而抗原的结构发生变化以后，就会对其免疫原性产生影响，所以需要在纯化过程中尽可能维持抗原的结构。/pp　　为了解决针对病毒及病毒样颗粒纯化的瓶颈问题，目前已有采用膜色谱、超大孔贯穿孔颗粒填料及整体柱的策略进行纯化的案例，成功纯化了包括人乳头瘤病毒、番茄花叶病毒、流感病毒、腺病毒、慢病毒及各种病毒样颗粒。/ppspan style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　　病毒及病毒样颗粒的分离纯化/strong/span/pp　　根据文献报道，超大孔填料相比传统层析填料不仅在载量及处理速度上有极大的优势，还更有利于病毒及病毒样颗粒的结构保持。/pp　　例如，在重组乙肝病毒表面抗原的分离纯化中，采用具有120nm及280nm超大孔径的离子交换填料DEAE-AP-120 nm和DEAE-AP-280 nm(商品名为中科森辉的Giga系列)具有比传统填料DEAE-FF高7倍以上的动态载量[1]。此外，采用ELISA测定抗原收率，发现采用超大孔填料能够减少重组乙肝病毒表面抗原在层析过程中的裂解，从而显著提高活性抗原的收率。/pp style="text-align: center "img width="576" height="450" title="1.jpg" style="width: 415px height: 282px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/3b67db18-4291-4ab6-9874-209cd57644af.jpg"/　　/pp style="text-align: center "重组乙肝病毒表面抗原在不同孔径离子交换填料上/pp style="text-align: center "　　的吸附动力学[1]/pp style="text-align: center "img width="497" height="345" title="2.jpg" style="width: 387px height: 289px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/07fdf233-77a5-4c30-8d20-faf7f044b54a.jpg"/　/pp style="text-align: center "　重组乙肝病毒表面抗原从不同孔径的填料上洗脱下来的/pp style="text-align: center "　　ELISA回收率[1]/pp　　对病毒的分离纯化同样有类似的效果。例如在灭活口蹄疫病毒的纯化中，DEAE-FF导致严重的病毒裂解。而采用具有100nm以上孔径的超大孔填料，不仅载量提高10倍以上，还能显著提高病毒在填料上吸附时的热稳定性，从而减少病毒的裂解，具有更高的收率。最终的分离纯化单步收率达90%以上[5]。/pp style="text-align: center "　　span style="font-size: 14px "strong灭活口蹄疫病毒在传统填料与超大孔填料上的吸附解离过程/strong/span/pp　　与商品填料的小孔道填料相比，超大孔结构可能从以下几方面提高对蛋白质构象的稳定性：/pp　　1)增大孔道(受限空间)：根据蛋白质折叠行为计算显示，蛋白质的折叠速率与空腔大小、形状密切相关，也即当填料孔道与蛋白的相对尺寸超过某一阈值后，蛋白的折叠行为将不受空腔大小影响。与数十纳米中孔结构的传统填料的相比，数百纳米超大孔结构会因孔道增大、与蛋白接触面积减小，从而对某一尺寸下蛋白质的变构行为有所改善。/pp　　2)界面曲率：小孔径填料孔道曲率大，填料与蛋白质接触面积大，因此受更大吸附力影响，蛋白质二级结构变化越严重。而曲率更大的超大孔孔道对蛋白二级结构的保护比狭窄孔道更有优势。/pp style="text-align: center "　span style="font-size: 14px "strong　表面曲率变化对蛋白接触面积的影响/strong/span/pp　　3)改善配基与蛋白活性区域的接触面积：超大孔微球内部数百纳米孔道在修饰配基后可能会有效改善传统填料狭窄孔道内由于配基拥挤造成的蛋白质失活现象。/pp　　4)减少蛋白在孔道内的静电排斥作用：有研究者认为，在离子交换填料上蛋白质起初会在孔道入口处形成一圈静电层，这一静电层会对后来蛋白继续进入孔道产生排斥作用从而使孔道关闭，动态载量下降。如果将超大孔填料修饰为离子交换树脂，由于孔道尺寸显著扩大可能会有效改善蛋白吸附静电层对孔道的封闭作用，从而有效引导蛋白质进入超大孔道，提高回收率。/ppspan style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　　快速分离蛋白质及pDNA/strong/span/pp　　除了应用于病毒及病毒样颗粒的分离纯化的分离纯化，利用超大孔填料传质速度快的优势，将超大孔填料镀上亲水表层，再接上不同配基制成多种形式的层析填料，用于快速高分辨率的纯化蛋白混合物或质粒。超大孔填料制备成的亲和层析、反相层析和离子交换层析填料广泛的应用在蛋白质的分离纯化方向，显示出超大孔填料比传统分离填料高速高分辨率的蛋白质纯化优势。/pp　　例如以肌红蛋白、转铁蛋白和牛血清白蛋白的混合溶液为模拟体系，考察不同流速下超大孔聚苯乙烯阴离子交换介质(DEAE-AP，商品名为Giga系列)的分离效果，并与DEAE 4FF介质进行了对比。实验结果(图2)显示，作为对照的DEAE-4FF介质在流速达到361 cm/h时，分离效果已明显降低，而超大孔介质可以在流速高达1084 cm/h的条件下操作，分离效果良好，能够在6 min内实现三种生物大分子的快速分离。/pp style="text-align: center "img width="588" height="170" title="3.jpg" style="width: 473px height: 144px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/65df31ac-bd00-4a08-8a5a-feedfa1aa990.jpg"//pp　span style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　超大孔填料应用前景与展望/strong/span/pp　　近年来，随着生命科学的发展，生物样品越来越复杂，如人的血样、尿样、组织样品等，对生物分离分析技术提出更高的要求。根据超大孔填料固有的诸多优点，通过合成不同种类的超大孔固定相及在固定相上做不同功能的衍生，超大孔填料已经被广泛应用于生物分离分析中，但也存在一些问题。因此，发展新的制备手段，优化制备条件和过程，探索制备和分离机理，对于开辟新的应用领域以及开展实际样品的分离分析有更大的理论和现实意义。/pp　　根据已有的文献报道，我们可以预测今后几年的相关工作仍会集中在以下几个方面：/pp　　(1)规则的聚合物整体材料内部形态。如获得规则的3D网络骨架，可控的孔径尺寸和分布。/pp　　(2)继续在微分离系统中扩展其应用。如在加压电色谱、微流控芯片材料、微流色谱和纳流色谱系统，甚至纳米器件开发等诸多方面大显身手。/pp　　(3)表面物理化学性质的调控向功能化、智能化方向发展。如基于分子印迹技术、温度响应以及pH响应的表面智能化的整体材料。/pp　　(4)制备规模整体柱的开发及其在生物下游技术中的应用。/pp　　目前，已经有一部分整体柱实现了商品化，但种类有限，还无法与种类繁多的颗粒型填充柱相提并论，也远未能满足分离分析的需求。而颗粒型的超大孔填料，由于其制备较困难、批次间重复性较差、价格昂贵等，也没有得到广泛的应用。相对于超大孔填充柱，有机相整体柱存在因流动相变会发生溶胀或收缩、机械强度差、比表面积小、柱容量差以及聚合过程中产生的微孔不利于小分子样品的分析等问题，现有报道大都用于生物大分子的分离。硅骨架整体柱也存在必须预先聚合好装入套管中，制备繁琐，比表面积较小的问题。因此，如何以更简便、有效的方式制备高效新型的超大孔填料并将其应用于实际样品的分离分析仍然是今后工作的重心。在实际工作中所面临的层出不穷的问题也是推动新型超大孔填料制备技术和方法发展的源源不竭的动力，在诸多的尝试中很可能就会出现某些性质优良的超大孔填料，这也预示着将来商品化的超大孔会越来越多。/ppspan style="color: rgb(0, 176, 240) "strong　　部分商品化的超大孔层析介质/strong/span/pp　　strong超大孔填料因其具有独特的多孔结构，与传统填料相比具有更加优良的渗透性和传质速率，可以在较低的操作压力下实现高效和快速的分离，已成为继多聚糖、交联与涂渍、单分散之后的第四代分离填料。可以预测，随着制备技术的不断提升，超大孔填料在生命科学、医药、环境和化学化工等领域必将大有可为。/strong/pp　　参考文献/pp　　[1] M.R. Yu, Y. Li, S.P. Zhang, X.N. Li, Y.L. Yang, Y. Chen, G.H. Ma, Z.G. Su, Improving stability of virus-like particles by ion-exchange chromatographic supports with large pore size: Advantages of gigaporous media beyond enhanced binding capacity, Journal of Chromatography A, 1331 (2014) 69-79./pp　　[2] P.M. Kramberger P, Boben J, Ravnikar M, ?trancar, A.S.m.c.a.b. in, p.a.f.q.o.t.m. virus., J. Chromatogr. A 1144(1)./pp　　[3] W. Zhou, J. Bi, J.-C. Janson, A. Dong, Y. Li, Y. Zhang, Y. Huang, Z. Su, Ion-exchange chromatography of hepatitis B virus surface antigen from a recombinant Chinese hamster ovary cell line, Journal of Chromatography A, 1095 (2005) 119-125./pp　　[4] W. Zhou, J. Bi, J.C. Janson, Y. Li, Y. Huang, Y. Zhang, Z. Su, Molecular characterization of recombinant Hepatitis B surface antigen from Chinese hamster ovary and Hansenulapolymorpha cells by high-performance size exclusion chromatography and multi-angle laser light scattering, Journal of Chromatography B, 838 (2006) 71-77./pp　　[5] S.Q. Liang, Y.L. Yang, L.J. Sun, Q.Z. Zhao, G.H. Ma, S.P. Zhang, Z.G. Su, Denaturation of inactivated FMDV in ion exchange chromatography: Evidence by differential scanning calorimetry analysis, BiochemEng J, 124 (2017) 99-107./pp/p

第七期蛋白质分离纯化专题研讨班于2010年6月23-24日在上海光大国际大酒店二层8号厅举办，本期研讨班由中国生物工程杂志社主办，内容涵盖蛋白质样品制备、纯化策略、过程优化，相关的产品规定、申报政策以及技术经济分析等，旨在帮助生命科学研究与生物技术应用领域的专业人员在短时间里高效率的掌握蛋白质分离纯化工具，提高蛋白质分离纯化实践中解决具体问题的能力。　　来自全国各高校、研究所从事相关研究共计150多位老师参加了这次研讨班，五洲东方作为特约赞助商也参加了此次研讨班。会议期间，很多老师对我公司展示的德国Brand移液器、德国Sigma离心机、美国BIOCOMP全自动密度梯度分离系统以及Merinton超微量紫外分光光度计等仪器均表示很大的兴趣。　　 　　工作人员在介绍液体操作产品　　 学员们在了解我公司产品

近日，《国务院关于加快培育和发展战略性新兴产业的决定》中将生物产业列为我国经济发展的支柱产业，这意味着生物技术及产业发展在未来时间将得到更多的资金和政策支持，以疫苗、抗体、蛋白质药物作等为主的生物产业必将得到快速发展。结合产业发展的需求，为帮助生命科学研究与生物技术应用领域的专业人员系统掌握蛋白质分离纯化工具与关键技术，中国生物工程学会继续教育工作委员会与中国生物工程杂志社在成功举办多次蛋白质产品分离纯化、生物工程下游技术、蛋白质组学专题研讨班的基础上，定于2010年12月4-5日在广州举办第九期蛋白质分离纯化技术专题研讨班。　　第九期蛋白质分离纯化专题研讨班的内容经过多位专家的反复提炼，综合了国内外蛋白质分离纯化领域的新技术、新方法，广泛吸纳往届参会代表的意见反馈和研发及产业工作中的实际需求。研讨班内容涵盖蛋白质样品制备、纯化策略、过程优化，相关的产品规定、政策解读以及技术经济分析等内容 同时突出重点和难点，例如基因工程上下游的整体策略、纯化中的具体难点，层析介质的选择等多方面，以及层析柱蛋白质失活等具体问题。本次研讨班由中国科学院从事制备与纯化技术的一线专家授课，并采用专家讲座为主、引导学员讨论实际案例为辅的学习方式，突出互动性以提高学习效果，从而可以在短时间里高效率的掌握蛋白质分离纯化工具，提高蛋白质分离纯化实践中解决具体问题的能力。　　研讨班主要内容：　　蛋白质样品的获得　　层析预处理原则与技术：离心、过滤、超滤、双水相抽提　　蛋白质层析，包括：　　(1)层析介质选择：层析介质特性对层析过程的影响——材质、孔径、官能团　　(2)层析技术：分子排阻、离子交换、疏水层析、金属螯合、亲和层析等　　(3)层析步骤整合方法：选择性、分辨率、动态载量、主要杂质的控制和去除　　(4)蛋白质纯化平台：适应于分子生物学实验室蛋白质纯化的方法和实例　　单克隆抗体纯化，包括：　　(1)单克隆抗体的生化性质　　(2)单克隆抗体纯化的工具　　(3)单克隆抗体纯化的策略和方案　　蛋白质纯化的溶液体系　　(1)蛋白质纯化的缓冲溶液组成和功能　　(2)各种层析模式的常用缓冲溶液的设计和使用　　蛋白质层析技术经济分析　　会议时间、地点：　　2010年12月4-5日，广州广大商务酒店(广州市大学城中环西路230号)　　报到时间：2010年12月3日　　报到地点：广州广大商务酒店　　参会办法：参会代表请于11月26日前填写会议回执后Email或传真至会议主办单位，会议费每人1600元，在读研究生每人1400元(凭有效证件)。食宿统一安排，费用自理。　　联系方式：　　通信地址：北京市海淀区中关村北四环西路33号中国生物工程杂志社(100190)　　联 系 人：任红梅13641036700　　电 话：(010)82624544，82626611-6511 传真：(010)82624544　　电子邮件：renhm@mail.las.ac.cn　　中国生物工程学会继续教育工作委员会、中国生物工程杂志社　　2010年11月第九期蛋白质分离纯化技术专题研讨班报名回执表(参会代表请于2010年11月26日前Emial/传真至主办单位)单位名称通信地址邮编姓名性别职称电话传真E-mail是否住会 第九期蛋白质分离纯化技术专题研讨班住宿预订表(住会者请务必2010年11月26日前回传本表，否则无法安排住宿)单位名称联系人电话手机电子邮件姓名性别是否需要单人间入住日期离店日期 　　报到及住宿酒店位置：　　会议住地：广州广大商务酒店(020-39360988)，标准间每天280元。地址：广州市大学城中环西路230号。　　具体路线：　　1. 从机场：乘坐机场大巴快线2号线至裕通大酒店(约22元)，换乘B25路公交车至广大生活区，即到广大商务酒店。或者乘坐地铁至大学城南站，换乘381、382路公交车至广大生活区，即到广大商务酒店。　　2. 从火车站：乘坐地铁至大学城南站，换乘381、382路公交车至广大生活区，即到广大商务酒店。(提示：广州火车总站、火车东站、火车南站均可乘坐地铁。到达火车北站的会议代表，可以先乘车到广州总站，之后再沿路线提示。)