液相色谱流通池清洗方法

相信很多小伙伴和我一样，在用液相色谱时会遇到仪器、管路等存在气泡问题，这些小气泡会影响实验过程的顺利程度及结果的可靠性，以下整理了几种出现气泡的情况以及对应的解决方法，大家如果遇到了，可参考对应着解决。1. 溶剂混合产生气泡这种情况比较多见，特别是配置流动相时，两种或多种溶剂混合，会导致液体热力学体积的变化，易产生气泡，这种气泡通常比较明显，有些还会挂在瓶壁或管壁上，晃一下可以看到有许多小气泡存在液体中。解决方案：对溶剂过滤，超声脱气，或者仪器上加装在线脱气机，或者充氮脱气，同时保持室内恒温。2. 泵排气或吸液时产生不间断小气泡这种情况有可能是过滤头被污染或部分堵塞，导致泵的吸力不均出现气泡。解决方案：根据过滤头的材质选择合适的处理方式，不可超声的可用10%的稀硝酸溶液浸泡后，用纯水清洗掉酸的残留；可超声的直接超声处理就可以了，必要时需更换新的滤头。3. 泵压力波动泵压力非正常波动时要注意，如果非管路气泡所致，就要考虑是否是单向阀或泵内部原因造成。解决方案：拆下泵头，用甲醇或异丙醇超声清洗单向阀、密封圈和泵头整体，用酒精棉花擦拭柱塞杆，必要时更换密封圈、单向阀、柱塞杆等。4. 进样时进气泡进样时带入气泡，或者进样针中带入气泡。解决方案：多次冲洗进样针，在进样前，注意排除进样针里的气泡。5. 色谱柱进气泡解决方案：这种情况气泡比较难排，可尝试用纯甲醇小流速长时间冲洗反相色谱柱，随后逐步加大流速直至1mL/min，直至色谱柱压力平稳。或者更换色谱柱。6. 流通池积存气泡如果流通池积存气泡，会对基线噪音造成较大影响，基线会很乱。解决方案：在不接色谱柱的前提下，可采用突然增大流量的方法来除气泡；或者启动输液泵的同时，用手紧压住废液管出液端，使池内增压，然后放开，反复操作数次，可去除流通池内的气泡。操作过程中需要观察吸光度值的变化，如果变化剧烈，说明流通池内有气泡未排出，待数值基本不变时，说明排气泡成功，再观察基线是否趋于平稳。需要注意的是，增压的时候不要增加太多，以免造成流通池破裂。

液相色谱是我们实验室十分常见且应用范围非常广泛的仪器之一，提到使用或方法开发可能各位看官都非常得心应手了，但是每当仪器出现问题时，小伙伴们想必是很头痛的吧。莫怕，今天小编就跟大家分享一个特别实用的故障排查方法——分段排查法。什么是分段排查法？分段排查法是通过分段试验，逐次缩小故障范围，直到找到故障点，该方法广泛应用于网络、交通、电路等众多领域，可以快速，便捷的诊断出故障来源，在液相色谱系统问题排查中起着十分重要的作用。接下来就跟老赵头一起来看看如何进行分段排查法进行液相色谱故障排查吧。HPLC分段排查实施步骤图一 液相色谱系统排查位置作为国产色谱柱的第一品牌，我们色谱柱的工程师经常会接到用户的反馈说柱压高了。仪器监控的压力升高，就一定是柱压高了吗？我们不能轻易做出结论，不能发现泵显示面板或工作站监控的系统压力升高就觉得是柱子堵了。系统压力监测由压力传感器完成，大多数液相色谱仪的压力传感器安装于泵头位置，系统压力通常由柱前压力、色谱柱反压、柱后压力组成。色谱实验过程中，养成良好的实验习惯，记录每天色谱柱及系统背压，当系统压力异常时可快速排查。当实验过程中压力升高时，想判断是不是色谱柱堵了还是很方便的，只需断开色谱柱连接，如图一中3和4的位置，断开3排查色谱柱，断开4排查保护柱或在线过滤器。若确定不是色谱柱及保护柱或在线过滤器堵了，可以用直通连接系统，分段排查液相色谱各模块。 01 检测器排查整个系统最末端的就是我们的检测器连接的废液管了，如图一中1位置所示。他除了排废液的作用之外，还给我们的流通池提供一定背压，防止流通池内产生气泡，长度是有要求的，请勿随意裁剪，一般装机时废液管是在实验台前端，有时关抽屉会不注意挤压到废液管或有弯折或堵塞的情况，这些情况都会造成系统压力升高，我们可以观察废液管排除此类情况。图二 背压管若废液管没有上述问题，我们进一步往前排查，断开检测器入口处接头，如图一2的位置，若压力降低，那么我们可以判断有可能是流通池堵了，进行相应的冲洗，若无法自行处理，可联系售后工程师。若断开位置2压力没有显著降低，则堵塞部位应该在其前端，我们继续往前排查。 02 柱温箱排查由于柱温箱内管路结构简单，排查比较方便，我们只需先检查下直通两端管路接头有无变形，有时peek管路使用时间久了会变形，当与色谱柱接触拧紧后会造成压力升高，此种情况，我们可以裁剪掉变形的管线即可。另外如管路堵塞，需冲洗或更换管路。 03 自动进样器排查由于市面上各品牌的自动进样器流路设计各不相同，按照样品进入样品环的方式分为两大类推注型和拉注型，拉注型自动进样器进样针在Inject状态下与进样口及其他管路组成闭合流路的，代表类型如安捷伦1260 、岛津Sil-20、赛默飞U3000等型号，这些仪器当进样针或针座堵塞时会导致压力升高，需要反冲或更换配件；而推注型的自动进样器，由于进样针将样品注入进样环后不参与进样流路切换，故进样针及针座即使堵塞也不会导致系统压力升高，代表如Wisys5000自动进样器，赛默飞AS-AP离子色谱自动进样器等。 04 泵的排查若自动进样也没有堵塞，那么堵塞的部位就是泵压力传感器之后，进样器之前的部位，此间断容易堵的部位是泵混合器、U型管等，可拆解超声清洗，必要时更换。有小伙伴可能会说单向阀、溶剂吸滤头也容易堵，是的！这些部位也是也容易堵，但他们导致的是压力低。接下来我们看看其他压力问题吧。 05 其他压力问题在液相色谱故障中涉及到压力跟泵有关系的案例还是很多的，压力升高，无压力，压力低，压力波动等。我们接下来具体看看。1. 无压力这种情况多数为不过液造成的，如管路中溶剂跑空，或单向阀处有气泡，无法正常吸液，或密封圈磨损，或是压力传感器故障或连接问题造成。防跑空小妙招：对于溶剂跑空的问题，我们有个小妙招可以解决此问题，设置泵的最小压力限值，设置数值如0.01等，另外在工作站中关注“瓶填充”中流动相瓶的容积，使设定值与溶剂实际量一致，当溶剂跑空时都会自动停泵。2. 压力低泵可以过液，但流量低于设置流量，此时多半是因为溶剂吸滤头、单向阀或泵内过滤组件堵塞造成,亦有接口位置漏液造成。3. 压力波动在流动相充分脱气后，有可能是气泡憋在单向阀位置，适当排气即可解决，或是其他位置有气泡造成，大流速purge观察效果。4.purge时高压有的小伙伴可能遇到过purge时超压报警停泵的情况，根据实际情况排查purge阀阀芯或主动阀过滤白头等位置。总结最后我们再来回顾一下当我们遇到液相系统压力高时应该如何排查，为了方便小伙伴们记忆，小编已将思维导图贴在下方。说明：本文仅针对大多数液相色谱仪的通常状况进行排查，不同品牌不同型号的液相色谱仪工作站功能及硬件结构有所不同，请参见自己使用的液相色谱仪手册或官方指导使用维护。

一枚合格的流通池，必须经得住长期压力，任劳任怨，经历成百上千次测试，一块面板上不止一颗螺丝钉，一台检测器却只有一枚流通池。一枚合格的流通池，需要满足以下要求：1获得理想的检测限；2获得理想的噪音、漂移和信号；3还在于成百上千次的检测后，质量如一，稳定可靠。流通池示意图我们先来看看紫外检测器的工作原理，紫外检测器的检测原理基于朗伯—比尔定律，吸光物质的吸光度与流通池的光程长度和浓度成正比。比尔—朗伯定律数学表达式：A=lg(1/T)=KbcA为吸光度，T为透射比（透光度），是出射光强度比入射光强度。K为摩尔吸光系数。它与吸收物质的性质及入射光的波长λ有关。c为吸光物质的浓度，单位为mol/L。b为吸收层厚度（流通池的长度），单位为cm。当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度（流通池的长度）b成正比，而与透光度T成反相关。检测器流通池的长度越长，光程越长，响应越高，检测限越低。定量分析的准确度很大程度上取决于浓度检测线性范围。分析液相的流通池光程通常比制备液相的流通池光程大，以获得低浓度下更好的响应。紫外检测器的光路示意图下面我们用一个实验来验证一下0.5mm, 1.25mm和3mm等三种不同光程的流通池，在同一色谱条件下，对同一个样品进行分析后，形成的色谱图的差异。由上图我们可以知道，使用较长光程的流通池检测同一个样品，生成的信号越强，获得更高的峰高，更好的响应。尽管通常增加光程会使噪声提高，但噪音提高幅度很小，信噪比还是会增大，一般适用于分析型液相色谱应用。使用小光程的流通池，峰高降低，但对某些峰有一定的分辨率，噪音较小，在应用上，一般适用于制备型液相色谱。