质谱技术细菌聚类分析

大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）和志贺菌（Shigella Castellani）都是具有高度传染性、危害严重的革兰阴性肠道致病菌, 病人感染后的临床表现相似，如发热、水样腹泻、剧烈腹痛等，严重可致死亡。临床上大肠埃希菌和志贺菌的正确鉴定对临床治疗非常关键，因为不同的菌株间有毒力和耐药性的差异，感染不同的致病菌，需要采用不同的治疗方案。从全基因组角度上，大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）和志贺菌（Shigella Castellani）的平均核苷酸一致率＞95% ，保守DNA＞69%，符合同一个种的定义，它们在菌落形态及生物学特性方面都非常相似，因此在临床实验室的常规工作中很容易被混淆，影响疾病的准确治疗。即使是通过16S rRNA 测序也只能鉴定到志贺菌-大肠埃希菌，并不能将其准确区分，进一步的鉴定需要依赖生化反应及血清学试验，但是这两种鉴定手段的实验步骤复杂、耗时很长，根本无法满足临床上对时效性的要求。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱( matrixassistedlaser desorption / ionization time of flight massspectrometry，MALDI-TOF MS) 是近年发展起来的一种新型软电离质谱技术，具有快速、准确、操作简便、高通量、低成本等优势，已经被广泛应用于微生物的分型鉴定。由于大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）和志贺菌（Shigella Castellani）基因水平上同属于一个种，特征性质谱图高度相似，如果仅仅使用目前常用的微生物分型算法进行数据库检索，仍然会有错误鉴定的情况存在。我公司基于自主知识产权的Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统平台，开发出了一套功能强大的人工智能算法，准确区分基因型相近的难辨菌的解决方案，如大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）和志贺菌（Shigella Castellani），准确度达到95%以上。我们利用Ebio ReaderTM 3700M 分别对福氏志贺菌(Sh.flexneri)、大肠埃希菌（E.coli）以及两种菌株的混合菌进行质谱鉴定以及蛋白质谱图比较分析。激光频率20 Hz，每个样本进行200次激光采集，采集相对分子质量 2000Da～15000Da的蛋白质图谱，通过数据分析软件对采集到的3个样品图谱进行比对分析。3种样品均在 2691、3737、4869、5381、6255、7274、9067、9743、10300 m /z 处出现相似的特征峰，其蛋白质谱图极为相似（图1），如果单纯通过数据库检索的话，极大可能会造成错误鉴定。 图1：大肠埃希菌、福氏志贺菌以及混合菌的质谱图之后，我们分别选取福氏志贺菌51例，大肠埃希菌56例，利用Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统进行质谱分析，通过神经网络软件比对观察两组细菌蛋白峰的差异，并运用强大的人工智能算法将采集到的谱图数据建立分类模型，然后利用此模型进行了盲样鉴定。结果可以将大肠埃希菌和福氏志贺菌完美地区分开，分离度分别达到99.5%和95.4%，混合菌的分类结果显示大肠埃希菌和福氏志贺菌分别为76.2%和23.8%，也说明了此样品为混合样本，且有一定的定量效果（如下表）。 通过软件的聚类分析功能，更加直观地显示我们建立的这套方案可以将大肠埃希菌和福氏志贺菌以及二者的混合菌有效的分离（图2）。 图2：大肠埃希菌、福氏志贺菌以及混合菌的聚类分析在此MALDI-TOF微生物自动鉴定检测系统中，公司使用了自主研发、具有深度学习分析功能的神经网络人工智能软件。通过上述案例证明此套人工智能算法可实现对大肠埃希菌和志贺菌的准确区分鉴定，弥补了质谱技术在鉴定亲缘关系相近菌种能力的不足，达到了精准医疗的目的，对临床诊断及治疗方面具有重要意义。

炎炎夏日，舒适又健康的运动莫过于游泳，然而游泳之后有人会出现眼部、耳朵或者皮肤的一些不适症状，这些有可能是泳池水中的微生物所导致的感染。目前，国内对外开放的正规游泳池池水都会用氯进行消毒处理，因为氯溶于水中时能分解成次氯酸和次氯酸盐这两种化学成分，这些化学成分会破解微生物的保护层。有些微生物是能够在氯的威力下被杀灭的，如容易引发淋病的淋病奈瑟菌、容易引发梅毒的梅毒螺旋体、容易引发腹泻的志贺氏杆菌、容易引发肺炎的军团杆菌，以及大肠杆菌、艾滋病毒，都是不能在消毒环境中存活的。但是，有些微生物是不能被消毒剂杀灭的，例如绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌（学名：Pseudomonas aeruginosa），它会引发炎症和脓肿。绿脓杆菌，1882年首先由Gersard从伤口脓液中分离到，是一种革兰氏阴性菌、好氧、呈长棒形的细菌，只有单向的运动性。它是一种机会性感染细菌，且对植物亦是机会性感染的，感染后因脓汁和渗出液等病料呈绿色，故得名。绿脓杆菌的分离培养及电镜照片（图片来源：中国科学院微生物研究所）绿脓杆菌感染可发生在人体任何部位和组织，严重时会引起心内膜炎、胃肠炎、脓胸甚至败血症。所以，当游泳后出现炎症和脓肿就医时，临床能否更快、更准确地鉴定是否为绿脓杆菌感染、或是其它微生物感染，就变得更加的重要了。精准医疗源于精准诊断全自动微生物质谱检测系统，是广州禾信康源医疗科技有限公司（以下简称“禾信康源”）在全面掌握核心技术和先进制造工艺下，历时5年，完全自主、正向开发的一款基于基质辅助激光解吸电离法（MALDI）的质谱检测系统，主要应用于微生物菌株鉴定、病毒核酸检测、蛋白多肽分析等方面，具有检测通量大、准确可靠、经济快速、样品耗费量少与操作简单等优势。质谱技术应用于细菌等微生物的快速鉴定分析，是利用标准菌株绘制微生物的蛋白质指纹图谱存储形成数据库。再将待检微生物的质谱数据图与数据库中的标准蛋白指纹图谱数据进行比对，从而实现细菌、真菌、分枝杆菌、厌氧菌等微生物的快速鉴定和分型，相比于表型鉴定、生理生化法、化学发光法等传统的微生物鉴定技术，质谱技术在鉴定速度、结果准确率、技术成本、质量控制、操作便捷等各方面都具有明显优势，是微生物检验技术史上一次里程碑式的革新。Figure 1禾信全自动微生物质谱检测系统实测铜绿假单胞菌硬件系统一体化免清洗离子源，集成独创的微小角度激光入射，有效提高灵敏度；智能化、高抽速真空泵系统，进靶即可采样，无需等待；超高频、长寿命固体激光器，信号采集及寿命均优于传统氮气激光器，使得样品分析速度更快，终身免维护；高稳定性信号采集系统，极大提升了仪器的重复性；模块化设计，内置前级泵，整机结构更加紧凑，维护简单。软件系统拥有自主知识产权的自动化控制采集软件，全过程智能化监控仪器状态，可自由切换多个数据库；提供专业的菌种中文名称，无需另外翻译，国内客户使用更便捷；多台云服务器同时执行鉴定，全面提升鉴定效率，可及时完成软件升级与数据库更新。数据库源于中国疾控中心（CDC）多年研究积累，品质保证，包含3500余种、60000余株菌种谱图，满足多应用领域的检测需求；数据库存于云服务器，可随时更新，客户也可根据自身需求建立自己的专属数据库。小贴士：如何找干净的泳池呢？1、看池水；要看水面有无颗粒漂浮，池底有无沉淀，池水的泡沫能否在15秒内消散。以8道泳池为例，站到泳池侧面穿过水面看第四、五泳道线，如果看不到说明水质不好。2、看证件；看看卫生许可证，员工健康证、卫生知识培训合格证等信息是否公示在游泳池旁，是否公示了当日水质情况，包括水温、PH值、余氯浓度、投放消毒药情况、循环水次数或新注入水量等。3、看池底；看看泳池底部，或泳池旁边的出水口，看是否有水源源不断进出的现象。如果有，则说明其水循环消毒装置在正常运作，可放心戏水游泳。4、看设施；正规的游泳池更衣后必须通过强制性淋浴和含有较高余氯的浸脚消毒池可以进入游泳池。

2013.8.21，FDA批准美国第一个质谱仪检测系统用于自动识别已知能导致人体严重疾病的细菌和酵母的上市。该质谱仪系统VITEK MS能鉴定出193不同微生物，可在一系列自动化测试过程中进行192种不同的测试，而且每个测试只需要大约一分钟。 　　谱仪系统VITEK MS可以鉴别诸如念珠菌、隐球菌和马拉色氏霉菌属组的酵母茵和葡萄球菌科、链球菌科、肠杆菌科、假单胞菌科和类杆属组的细菌，这些酵母茵和细菌跟皮肤感染、肺炎、脑膜炎和血液感染有关。HIV或AIDS、癌症治疗或器官移植后的抗排斥治疗损害或削弱免疫系统的患者特别容易受到这些细菌感染。 　　VITEK MS采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术,该技术利用激光打破酵母和细菌标本成小颗粒,形成一个独特的微生物模型。VITEK MS在检测系统数据库自动将这些微生物模型与193种已知的酵母和细菌进行比对，从而鉴别微生物。 　　此与其他要求大量微生物繁殖来检测的鉴别方法相比,质谱分析方法只需要少量的酵母或细菌繁殖,所以只要微生物生长到可视程度后就可以马上开始检测，通常在在18到24小时内。传统的方法需要五天才能得出相同的鉴别结果。 　　FDA通过新型分类程序审查了VITEK MS,这是对一些新型低中度风险且不完全等同于已知合法市售的医疗设备的调控途径。 　　VITEK MS再临床上用于鉴别由人体标本培养得到的微生物，它与联合其它临床和实验室发现相互结合，从而辅助诊断细菌和真菌感染。 　　VITEK MS的制造商为北卡罗来纳州达勒姆的生物梅里埃公司。